白術(shù)多糖的分子量及其單糖組成分析

王少杰，巴娟，張勇軍，鄧樺，蒲文珺，楊鴻

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院， 廣東 佛山 528231)

中藥白術(shù)為白術(shù)的根莖，切厚片生用或土炒、麩炒用，炒至黑褐色稱(chēng)為焦白術(shù)。其性苦、甘、溫。歸脾、胃經(jīng)。具有扶植脾胃、散濕除痹、消食除痞、安胎之功效。白術(shù)多糖作為中藥白術(shù)的主要活性成分具有免疫調(diào)節(jié)作用，能增加脾臟和胸腺的重量，增強(qiáng)小鼠脾淋巴細(xì)胞免疫功能，提高T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率和增殖反應(yīng)，可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答[1-3]。白術(shù)多糖具有抗氧化、抗衰老、降血糖、抗腫瘤、促進(jìn)胃腸粘膜損傷修復(fù)等作用[4-11]。白術(shù)多糖還可應(yīng)用于抗菌消炎、抑制痢疾桿菌與傷寒桿菌、提高抗氧化功能、抑制紅細(xì)胞溶血、促發(fā)育、提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抑制血液凝固、擴(kuò)張血管、保護(hù)放射線侵害等諸多方面[12-14]。

中藥多糖的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)不完善(僅檢測(cè)總糖含量)，會(huì)對(duì)市場(chǎng)秩序產(chǎn)生一定的影響。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)白術(shù)多糖的提取、純化，采用高效凝膠色譜(HPLC-GPC)法測(cè)定白術(shù)多糖的分子量大小及分布情況，采用薄層色譜(TLC)法及柱前衍生化HPLC法進(jìn)行單糖組成種類(lèi)和物質(zhì)的量比的測(cè)定，為實(shí)現(xiàn)有效地對(duì)白術(shù)多糖進(jìn)行質(zhì)量控制提供了一種可靠的定性定量檢測(cè)方法，可作為白術(shù)多糖質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的參考與借鑒。

1 材 料

1.1 儀器 真空冷凍干燥機(jī)：美國(guó)LABCONCO公司；RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州予華儀器制造有限公司；雷蒙實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)用超純水機(jī)：重慶利迪實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備有限公司；HN1012超聲波清洗機(jī)：廣州市華南超聲設(shè)備有限公司；不銹鋼電熱去離子水器：上海傳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；XZ-1型真空泵：黃巖求精真空泵廠；BSA224S-CW電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；LC-20A高效液相色譜儀：島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司；島津DGU-20A系列高效液相色譜儀：島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司；G1362A示差折光檢測(cè)器(RID)：安捷倫科技(中國(guó))有限公司；雷磁PHS-3C PH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；H1650-W臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 試劑 中藥白術(shù)購(gòu)自北京同仁堂藥店佛山分店；AB-8大孔樹(shù)脂、無(wú)水乙醇均為分析純；D-甘露糖(批號(hào)：140651-201403)、鼠李糖(批號(hào)：111683-201502)、D-核糖(批號(hào)：140668-201302)、D-半乳糖醛酸(批號(hào)：111646-200301)、阿拉伯糖(批號(hào)：1506-200001)、D-木糖(批號(hào)：111508-200404)、果糖(100231-201305)對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；D-葡萄糖(批號(hào)：201705)、D-半乳糖(批號(hào)：201705)對(duì)照品購(gòu)自上海瑞楚生物科技有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、三氟乙酸(TFA)、鹽酸、氫氧化鈉、丙酮、正丁醇、異丙醇、乙酸乙酯、苯胺、二苯胺、磷酸均為分析純；乙腈、甲醇均為色譜純。

2 方 法

2.1 白術(shù)多糖的制備及含量測(cè)定[15]將中藥白術(shù)采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化水提醇沉淀的提取工藝，提取條件為提取溫度90 ℃、料液比1∶16、提取時(shí)間1.5 h，重復(fù)提取3次。將提取的粗多糖經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂純化濃縮，真空冷凍干燥即得精制多糖，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。

2.2 白術(shù)多糖分子量與化學(xué)均一性檢測(cè)

2.2.1 色譜條件 島津DGU-20A系列高效液相色譜儀；G1362A示差折光檢測(cè)器(RID)；高效液相色譜柱：SB-806M HQ(8.0 mm×300 mm)；TSK PWXL保護(hù)柱(6.0 mm×40 mm)；流動(dòng)相：超純水；流速：0.7 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2.2 進(jìn)樣溶液配制 分別稱(chēng)取9個(gè)T-dextran系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(相對(duì)分子量7000-700000 Da)各2 mg，1 mL去離子水溶解，離心(6000 rpm，5 min)后取上清液，采用相同方法分別配制白術(shù)多糖溶液。

HPLC-GPC法測(cè)定多糖的數(shù)均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)、Z均分子量(Mz)。由島津數(shù)據(jù)分析軟件分析處理得出。根據(jù)多糖樣品的色譜圖判斷多糖的化學(xué)均一性。

2.3 柱前衍生化HPLC法檢測(cè)白術(shù)多糖的單糖組成

2.3.1 水解多糖樣品 稱(chēng)得兩份50 mg純化后的多糖樣品，分別放入不同的10 mL具塞試管與2 mol/L的三氟乙酸溶液2 mL混合均勻，置于97 ℃水浴鍋反應(yīng)8 h，然后用4 mol/L NaOH調(diào)節(jié)PH至中性，離心并過(guò)濾。

2.3.2 多糖與單糖樣品衍生化 分別將5 mg的D-甘露糖、D-半乳糖、D-核糖、鼠李糖、D-葡萄糖、阿拉伯糖D-半乳糖醛酸定容于25 mL容量瓶中即可得到單糖標(biāo)準(zhǔn)品的混合樣品。取100 μL混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品、 50 μL的0.3 mol/L NaOH溶液、50 μL的0.5 mol/L PMP 甲醇溶液充分混合，水浴加熱30 min。冷卻后加入 50 μL的0.3 mol/L HCl中和溶液，分別以1 mL 氯仿進(jìn)行3次萃取，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，備用[16]。用同樣的方法進(jìn)行衍生化處理白術(shù)多糖水解樣品100 μL。

2.3.3 色譜條件 Wondasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖溶液(pH6.9)-乙腈(85∶15)；40 ℃柱溫；1.0 mL/min流速；20 μL進(jìn)樣量；254 nm檢測(cè)波長(zhǎng)。以混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品和白術(shù)多糖水解樣品的衍生化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，得到分離良好的色譜峰。

2.3.4 方法學(xué)試驗(yàn) 精密度考察：取衍生化后的標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積的RSD值考察試驗(yàn)的儀器精密度；重復(fù)性考察：取衍生化產(chǎn)后的白術(shù)多糖樣品連續(xù)進(jìn)樣6次；穩(wěn)定性考察：取白術(shù)多糖的衍生化產(chǎn)物分別于0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣。回收率考察：于樣品中分別加入樣品含量一半的100%、120%和150%的單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液進(jìn)行測(cè)定。

2.3.5 線性試驗(yàn) 分別進(jìn)樣1、2、4、6、8、10 μL單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，對(duì)各單糖用峰面積進(jìn)行質(zhì)量濃度回歸。

2.3.6 各單糖的物質(zhì)的量比[17]計(jì)算方法：按式①、②計(jì)算兩種單糖之間的校正因子f1/2和這兩種單糖的比例R1/2。

① f1/2=(A2/m2)/(A1/m1)

A1、A2 分別為混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液中單糖1、2 的峰面積，m1、m2 分別為標(biāo)準(zhǔn)品溶液中單糖1、2 的質(zhì)量濃度。

② R1/2=f1/2×(A'1/A'2)

A'1、A'2分別為樣品中單糖1、2的峰面積。

3 結(jié)果與分析

3.1 白術(shù)多糖制備和含量測(cè)定 最佳提取條件為：浸提時(shí)間1.5 h、浸提溫度90 ℃、提取次數(shù)3次，之后抽濾、濃縮提取液，無(wú)水乙醇沉淀濃縮液12 h，取沉淀物經(jīng)真空干燥，得白術(shù)粗多糖。經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂純化的白術(shù)多糖含量可達(dá)91%以上。

3.2 白術(shù)多糖分子量及化學(xué)均一性檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)HPLC-GPC法檢測(cè)，白術(shù)多糖的化學(xué)均一性良好，基本呈現(xiàn)單一峰形，見(jiàn)圖1。經(jīng)測(cè)定，白術(shù)多糖中Mw≈3500小分子多糖占其97%，Mw≈50000000的大分子占其3%；從多糖樣品的聚合物分散性指數(shù)(PDI)可以看出白術(shù)多糖的PDI較小，分子量分布較均勻，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 白術(shù)多糖分子量分布結(jié)果Tab 1 Results of molecular weight distribution of atractylodes macrocephala polysaccharide

圖1 白術(shù)多糖HPLC-GPC色譜及分子量分布圖Fig 1 HPLC-GPC chromatography and molecular weight distribution of atractylodes macrocephalaon polysaccharides

3.3 柱前衍生化HPLC法檢測(cè)白術(shù)多糖的單糖組成結(jié)果

3.3.1 方法學(xué)試驗(yàn) 精密度考察：D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖RSD值分別為1.13%、0.90%、0.49%、0.70%、0.57%、1.53%、1.52%；D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的RSD值分別為0.38%、0.55%、1.34%、1.61%；穩(wěn)定性考察：D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖RSD值分別為0.46%、0.43%、0.69%、1.33%。表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定?；厥章试囼?yàn)：計(jì)算得D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的平均回收率分別為98.8%，98.5%，98.6%，97.2%；RSD值為1.40%，0.30%，0.68%，1.18%。

3.3.2 線性試驗(yàn) 對(duì)各單糖用峰面積進(jìn)行質(zhì)量濃度回歸，線性結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Tab 2 Standard curve equation of monosaccharide

3.3.3 單糖對(duì)照品與白術(shù)多糖的HPLC分析色譜圖 將單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合樣品與白術(shù)多糖的衍生化產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果顯示：D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的衍生化物分別在22.76、27.95、31.34、33.59、44.38、49.47、53.62 min左右出現(xiàn)吸收峰，見(jiàn)圖2；對(duì)比白術(shù)多糖圖譜，在部分相同的位置有吸收峰與其對(duì)應(yīng)?？梢源_定白術(shù)多糖由D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖4種單糖組成，見(jiàn)圖3。

3.3.4 白術(shù)多糖的物質(zhì)的量比 通過(guò)計(jì)算得出白術(shù)多糖中D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的物質(zhì)的量比為1∶239∶18.6∶19.3，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 白術(shù)多糖中各單糖的物質(zhì)的量比計(jì)算結(jié)果Tab 3 The ratio of the amount of monosaccharide substance in atractylodes macrocephalaon polysaccharides

1 D-甘露糖，2 D-核糖，3 鼠李糖，4 D-半乳糖醛酸，5 D-葡萄糖，6 D-半乳糖，7 阿拉伯糖1 D-mannose, 2 D-ribose, 3 Rhamnose, 4 D-galactose uronic acid, 5 D-glucose, 6 D-galactose, 7 Arabia sugar圖2 單糖對(duì)照品HPLC分析色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of monosaccharide control article

1 D-甘露糖，5 D-葡萄糖，6 D-半乳糖，7 阿拉伯糖1 D-mannose,5 D-glucose, 6 D-galactose, 7 Arabia sugar圖3 白術(shù)多糖HPLC分析色譜圖Fig 3 HPLC chromatogram of atractylodes macrocephalaon polysaccharides

4 討論與結(jié)論

4.1 方法條件優(yōu)化

4.1.1 提取工藝優(yōu)化 中藥白術(shù)采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化水提醇沉淀的提取工藝，得出的最佳提取條件為提取溫度90 ℃、料液比1∶16、提取時(shí)間1.5 h，重復(fù)提取3次；通過(guò)與三氟三氯乙烷法、Sevag法、酶法、三氯乙酸法、透析膜透析法等方法對(duì)比后，最終選擇純化效果最好的“AB-8大孔樹(shù)脂法”進(jìn)行純化。

4.1.2 分子量測(cè)定方法的選擇 通過(guò)與黏度法、光散射法和超速離心沉降速度法等方法對(duì)比以后，選擇用GPC法測(cè)定白術(shù)多糖的分子量是因?yàn)镚PC法相比之下測(cè)定更加精確，操作便捷，可以根據(jù)相關(guān)軟件快速準(zhǔn)確地分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4.1.3 白術(shù)多糖單糖組成方法的選擇 在用高效液相色譜法分析多糖組成及其含量時(shí)，由于多糖和單糖都不具有紫外吸收，無(wú)法直接對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，所以一般采用凝膠色譜柱與示差折光檢測(cè)器或蒸發(fā)光散射檢測(cè)器等儀器，這些方法不僅靈敏度低、基線噪音大、柱溫對(duì)結(jié)果影響較大、測(cè)定過(guò)程中易發(fā)生單糖轉(zhuǎn)化并且這些儀器與色譜柱價(jià)格高昂。因此本試驗(yàn)先對(duì)YPF-P進(jìn)行水解和衍生化處理，再采用高效液相色譜法(HPLC)分析其單糖組成及其物質(zhì)量比，此方法不僅可以準(zhǔn)確高效地測(cè)定白術(shù)多糖的單糖組成還極大地降低了檢測(cè)成本。

4.2 結(jié)論 通過(guò)對(duì)白術(shù)多糖的分子量測(cè)定，可以了解白術(shù)多糖的分子量大小以及分子量分布情況。通過(guò)柱前衍生化HPLC法對(duì)白術(shù)多糖進(jìn)行單糖組成種類(lèi)和物質(zhì)的量比的測(cè)定，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)白術(shù)多糖準(zhǔn)確的定性定量。試驗(yàn)通過(guò)對(duì)白術(shù)多糖的分子量大小與分布情況以及單糖組成分析，對(duì)白術(shù)多糖進(jìn)行了定性定量的考查。試驗(yàn)建立的方法穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、樣品用量少、容易操作。研究為白術(shù)多糖實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制提供了一種可靠的定性定量的新思路。