HPLC-DAD法檢測馬波沙星片中馬波沙星氧化物的研究

趙晶晶

(山西省飼料獸藥監(jiān)察所,太原 030027)

馬波沙星是隸屬于喹諾酮類抗菌藥，目前已在英國、法國、美國和歐洲上市并被列為動物專用藥，馬波沙星對多數(shù)腸桿菌、多殺性巴斯德氏菌、綠膿桿菌、金黃葡萄球菌、中間葡萄球菌的抑制和殺滅作用與恩諾沙星和環(huán)丙沙星相當(dāng)，對紅霉素、林可霉素、氯霉素、強(qiáng)力霉素、磺胺藥的耐藥病原菌依然有效。馬波沙星組織滲透力強(qiáng)，在體內(nèi)吸收迅速、完全、分布廣泛，消除半衰期長，安全劑量范圍寬，無明顯生殖和遺傳毒性[1-3]。無論是肌肉注射還是口服給藥，生物利用度都高[4]。目前馬波沙星已能在國內(nèi)大規(guī)模生產(chǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

藥物雜質(zhì)影響藥物質(zhì)量和療效,有必要掌握藥物雜質(zhì)的產(chǎn)生并采取一定的措施嚴(yán)格控制藥品質(zhì)量。藥物的副作用與雜質(zhì)有一定的相關(guān)關(guān)系,掌握微量雜質(zhì)的形成并避免藥物副作用具有重要意義[5]。研究人員采用高效液相色譜[6-7]及高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜[8]的方法分析馬波沙星及其代謝產(chǎn)物,以期對馬波沙星藥物評價(jià)提供一定的支持。 馬波沙星化學(xué)名為9-氟-2,3-二氫-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧代-7H-吡啶-[3,2,1-ij](4,1,2)苯并惡二嗪-6-羧酸，分子式為C17H19FN4O4，在貯藏過程中會產(chǎn)生雜質(zhì)，其中以氧化雜質(zhì)最為明顯，氧化產(chǎn)物為1-氧-4-[9-氟--3-甲基-7-氧代2,3-二氫-7H-吡啶--[3,2,1-ij](4,1,2)苯并惡嗪-10-二甲基氨基]甲基哌嗪-6-羧酸,因而通過對氧化雜質(zhì)含量的檢測，可以對產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性做出判斷。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器 安捷倫1100高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器。超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司，KQ-250型。水浴鍋，德國JULABO,TW12型。

1.1.2 對照品 馬波沙星對照品，含量為100.0%，批號為PMAB160301B，馬波沙星氧化物對照品含量為99.9%，批號為MABF-YXM-2028-007,二者均來源于海門慧聚藥業(yè)有限公司。

1.1.3 其他試劑 甲醇為色譜純試劑；其他試劑均為分析純試劑。

1.1.4 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液 取磷酸二氫鉀1.1998 g，置1000 mL量瓶中，加水950 mL使溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.6，用水稀釋至刻度。

1.1.5 辛烷磺酸鈉磷酸鹽緩沖液 取辛烷磺酸鈉2 g，置1000 mL量瓶中，加0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋至刻度。

1.1.6 稀釋溶劑[9]取0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液650 mL，加甲醇320 mL,四氫呋喃30 mL,攪拌搖勻，過濾。

1.1.7 硼酸-氯化鉀緩沖液(pH 9.0)[10]取硼酸3.09 g，加0.1 mol/L氯化鉀溶液500 mL使溶解，再加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液210 mL，混勻。

1.1.8 馬波沙星片 法國威隆制藥股份有限公司(VETOQUINOL S.A.)生產(chǎn)，規(guī)格80 mg。

1.2 溶液的制備

1.2.1 馬波沙星氧化物對照品儲備液的配制 取馬波沙星氧化物對照品50.05 mg，精密稱定，置500 mL量瓶中，用水使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為氧化物對照品儲備液。

1.2.2 馬波沙星對照品溶液的配制 取馬波沙星對照80 mg，精密稱定，置200 mL量瓶中，用1.1.6項(xiàng)稀釋溶劑稀釋至刻度，搖勻，超聲處理5 min，置60 ℃水浴振蕩3 min后，再超聲處理10 min，搖勻，作為馬波沙星對照品儲備液。取3.00 mL儲備液置100 mL容量瓶中，用稀釋溶劑稀釋至刻度，作為馬波沙星對照品溶液。

1.2.3 馬波沙星氧化物標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制 分別精密量取氧化物對照品儲備液5、3、5、10、5、2、1、1 mL置10、10、25、100、100、100、100、200 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品工作液濃度分別為50、30、20、10、5、2、1、0.5 μg/mL。

1.2.4 供試品溶液的配制[9]取馬波沙星片10片，研細(xì)，精密稱取適量，約相當(dāng)于馬波沙星0.1 g，置100 mL量瓶中，用硼酸-氯化鉀緩沖液(pH 9.0)溶解并稀釋至刻度，搖勻，超聲處理5 min，置60 ℃水浴振蕩3 min后，再超聲處理10 min，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，置50 mL量瓶中，用稀釋溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

1.2.5 光照破壞樣品溶液的配制 取馬波沙星片10片置玻璃平皿中，放在4500 lx的燈下照射1 d，研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于馬波沙星0.1 g)按1.2.4項(xiàng)方法配制，作為光照破壞樣品溶液。

1.2.6 添加樣品溶液的配制 農(nóng)業(yè)部2329號公告中，馬波沙星氧化物限量為不得過0.5%(W/W)，以此限度作為中間濃度，分別制備3個(gè)濃度的樣品。取馬波沙星片30片，研細(xì)，精密稱取9份樣品，每份樣品約相當(dāng)于馬波沙星0.2 g，添加氧化物對照品三個(gè)濃度，分別添加 0.8、1、1.2 mg，每個(gè)濃度添加三份。完成添加后，置200 mL量瓶中，用硼酸-氯化鉀緩沖液(pH 9.0)溶解并稀釋至刻度，搖勻，超聲處理5 min，置60 ℃水浴振蕩3 min后，再超聲處理10 min，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，置50 mL量瓶中，用稀釋溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為添加樣品溶液。

1.2.7 馬波沙星與馬波沙星氧化物混合溶液的配制 取1.2.2項(xiàng)馬波沙星對照品儲備液15、20、25 mL分別置50 mL容量瓶中；取1.2.3項(xiàng)中濃度為5 μg/mL的馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液10、20、30 mL分別置上述3個(gè)容量瓶中，用稀釋溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為混合溶液1～3。

1.3 色譜條件 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠，4.6 mm×250 mm，5 μm。柱溫 30 ℃。流動相：辛烷磺酸鈉磷酸鹽緩沖液-甲醇-四氫呋喃(65∶32∶3)。流速1.0 mL/min。檢測波長210～400 nm，分辨率1.2 nm。記錄298 nm波長處的色譜圖。進(jìn)樣量 10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 準(zhǔn)確度 取1.2.6項(xiàng)添加樣品溶液按1.3項(xiàng)色譜條件檢測，結(jié)果見表1。

2.2 重復(fù)性 取1.2.7項(xiàng)馬波沙星與馬波沙星氧化物混合溶液1～3，按1.3項(xiàng)色譜條件檢測，每份樣品測定3次，計(jì)算馬波沙星及馬波沙星氧化物的響應(yīng)因子，以響應(yīng)因子作為評價(jià)依據(jù)，結(jié)果見表2。

表1 準(zhǔn)確度測定結(jié)果Tab 1 Accuracy test results

表2 重復(fù)性測定結(jié)果Tab 2 Repeatability test results

續(xù)表

馬波沙星氧化物相對于馬波沙星的相對響應(yīng)因子為1.03。

2.3 線性 吸取1.2.3項(xiàng)馬波沙星氧化物標(biāo)準(zhǔn)工作液和1.2.1項(xiàng)氧化物對照品儲備液，按照1.3項(xiàng)所述色譜條件測定，標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖見圖1，測定結(jié)果見表3。以峰面積為縱坐標(biāo)，以馬波沙星氧化物質(zhì)量濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)線性回歸，得回歸方程為：Y=320.74X+56.382 (r2=0.9997)，檢測結(jié)果表明，在0.5～100 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

表3 線性測定結(jié)果Tab 3 Linear measurement results

2.4 專屬性 取1.2.2項(xiàng)馬波沙星對照品溶液及1.2.5項(xiàng)光照破壞樣品溶液，按照1.3項(xiàng)色譜條件測定，檢測結(jié)果見圖1～圖6，馬波沙星與馬波沙星氧化物在檢測過程中相互不干擾，馬波沙星在光照條件下不穩(wěn)定，由光照破壞樣品溶液檢測結(jié)果來看，馬波沙星片產(chǎn)生的其他雜質(zhì)與馬波沙星氧化物峰的分離度良好，試驗(yàn)中采用了DAD檢測器，在298 nm的色譜圖上，馬波沙星氧化物的相對保留時(shí)間為1.5，光譜圖中馬波沙星氧化物的吸收峰值的位置與馬波沙星是相同的，用以上兩點(diǎn)可以區(qū)分馬波沙星氧化物和其他雜質(zhì)，說明本分析方法可以較好地排除干擾，專屬性強(qiáng)。

2.5 檢測限 將1.2.6項(xiàng)中低濃度添加樣品逐步稀釋檢測，以信噪比為3∶1時(shí)馬波沙星氧化物的濃度作為檢測限(圖7)，檢測限為0.2 μg/mL。

2.6 定量限 將1.2.6項(xiàng)中低濃度添加樣品逐步稀釋檢測，以信噪比為10∶1時(shí)馬波沙星氧化物的濃度作為檢測限，定量限為0.5 μg/mL。

2.7 范圍 根據(jù)2.3、2.4、2.5、2.6項(xiàng)的結(jié)果分析，馬波沙星氧化物的濃度范圍在0.2～100 μg/mL范圍內(nèi)均可獲得可靠結(jié)果。根據(jù)農(nóng)業(yè)部2329號公告該物質(zhì)的限度為不得過0.5%(W/W)，按1.2.4項(xiàng)方法配制樣品時(shí)，該限度在被測溶液中的濃度為1 μg/mL。因而，檢測限、定量限、限度均在檢測范圍之內(nèi)。

圖1 馬波沙星氧化物圖譜(1 μg/mL)Fig 1 Marbofloxacin oxide chromatogram(1 μg/mL)

圖2 馬波沙星對照品圖譜(12 μg/mL)Fig 2 Marbofloxacin chromatogram (12 μg/mL)

圖3 馬波沙星與馬波沙星氧化物混合溶液圖譜(馬波沙星120 μg/mL、馬波沙星氧化物1 μg/mL)Fig 3 Marbofloxacin and Marbofloxacin oxide chromatogram(Marbofloxacin 120 μg/mL、Marbofloxacin oxide 1 μg/mL)

圖4 光照破壞馬波沙星片樣品圖譜Fig 4 Marbofloxacin tablets chromatogram

圖5 馬波沙星氧化物光譜Fig 5 Marbofloxacin oxide spectrogram

圖6 馬波沙星光譜Fig 6 Marbofloxacin oxide spectrogram

圖7 檢測限圖譜(0.2 μg/mL)Fig 7 limit of detection chromatogram(0.2 μg/mL)

2.8 耐用性 對流動相組成、緩沖液pH值、柱溫、流速、色譜柱的品牌、柱長等因素進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)流動相比例在±5%，緩沖液pH值在±0.2 pH單位內(nèi)，檢測結(jié)果較為穩(wěn)定，流速、色譜柱的品牌、柱長對保留時(shí)間影響明顯，但馬波沙星氧化物的相對保留時(shí)間均在1.5左右。柱溫在±2 ℃范圍內(nèi)，相對保留時(shí)間較為穩(wěn)定。

3 討 論

任何影響藥物純度的物質(zhì)均可能具有潛在的生物活性，藥品在臨床使用中產(chǎn)生的不良反應(yīng)除了與藥品本身的藥理活性有關(guān)外，與藥品中存在的雜質(zhì)也有很大關(guān)系。因而在藥品生產(chǎn)和貯存過程中控制藥品中雜質(zhì)的含量是非常必要的。在實(shí)際檢測工作中，要求雜質(zhì)的檢測方法既能保證藥品質(zhì)量可控，又能方便快捷地完成檢測工作。尤其在新產(chǎn)品、新劑型研發(fā)過程中根據(jù)每種藥物獨(dú)有的理化性質(zhì)及穩(wěn)定性情況，研究制定適宜的雜質(zhì)檢測方法成為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的重要一環(huán)。馬波沙星經(jīng)加速和長期穩(wěn)定性試驗(yàn),在避光條件下保存具有較好的穩(wěn)定性[11-12]，但在光照條件下，會出現(xiàn)多種雜質(zhì)，氧化物是最明顯的雜質(zhì)，在查詢到的相關(guān)文獻(xiàn)中未見專門就馬波沙星氧化物與馬波沙星含量用高效液相色譜二極管陣列檢測器檢測結(jié)果的論述。本文的方法，用色譜圖中的保留時(shí)間,結(jié)合光譜圖最大吸收峰的位置,可以有效區(qū)分馬波沙星氧化物與其他雜質(zhì)，因而用馬波沙星氧化物可以作為馬波沙星片穩(wěn)定性的標(biāo)志物，通過控制馬波沙星氧化物的含量來控制馬波沙星片的雜質(zhì)水平。由于馬波沙星氧化物與馬波沙星的結(jié)構(gòu)十分相近[5]，發(fā)色基團(tuán)是一致的，從本文的檢測結(jié)果可以證實(shí)：二者光譜圖基本一致，均在298 nm波長處有最大吸收，色譜圖中馬波沙星氧化物相對于馬波沙星的相對響應(yīng)因子為1.03。所以分析后認(rèn)為，在馬波沙星片有關(guān)物質(zhì)的檢測中可以采用自身對照的方法來檢測并控制馬波沙星氧化物的含量，這樣更方便，更快速，可以避免馬波沙星氧化物對照品的購置，線性溶液的配制及繁瑣的計(jì)算。為避免在檢測過程中產(chǎn)品受光照的影響，建議在檢測過程中最好使用棕色容量瓶完成檢測。