醬油種類及添加量對牛肱二頭肌的嫩化作用

黃艷玲 任昊天

摘? 要：研究醬油種類及添加量對牛肱二頭肌的嫩化作用。將3 種質(zhì)量濃度15 g/100 mL的醬油溶液與3 g /100 mL的食鹽溶液按不同的比例混合，配制9 組腌制液，并以3 g/100 mL的食鹽溶液作為對照組（記為C0），按肉液比為1∶4（m/V）將牛肱二頭肌肉塊（2.5 cm×2.5 cm×2.5 cm）腌制72 h（4 ℃），分析醬油種類及添加量對肉樣pH值、剪切力、膠原蛋白含量、肌節(jié)長度及肌原纖維碎裂指數(shù)（myofibrillar fragmentation index，MFI）等指標(biāo)的影響。結(jié)果表明：醬油腌制會降低肉樣的pH值（P<0.05），但對肉樣的持水力和總膠原蛋白含量無顯著影響（P>0.05）;醬油含量高的腌制液具有更低的pH值，使肉樣的可溶性膠原蛋白含量及MFI變大、肌節(jié)長度變短，進(jìn)而提高肉的嫩度;當(dāng)腌制液中的醬油比例較高時，肉樣的嫩度與多汁性感官評分更高，總體可接受度更好。在3 種醬油中，低pH值醬油對牛肱二頭肌的嫩化效果更好。

關(guān)鍵詞：牛肱二頭肌;醬油;腌制;嫩度

中圖分類號：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2019）02-0046-06

Abstract： This experiment aims to study the effect of type and concentration of soy sauce on the tenderization of bovine biceps brachii muscle. Nine marinades were prepared by blending one of three types of soy sauce （15 g/100 mL） with salt solution （3 g/100 mL） at different ratios. Salt solution was used as a control. Muscle samples were cut into cubes 2.5 cm ×2.5 cm × 2.5 cm and marinated for 72 h at 4 ℃. The effect of type and concentration of soy sauce on pH value， shear force， collagen content， sarcomere length and myofibril fragmentation index （MFI） were analyzed. The results showed that marination with soy sauce reduced the pH value （P < 0.05）， but had no effect on the water-holding capacity or total collagen content （P > 0.05）. The marinade with higher soy sauce content resulted in lower pH value， higher soluble collagen content， higher MFI， shorter sarcomere length and consequently improved meat tenderness. Better tenderness， higher sensory scores for juiciness and better overall consumer acceptance were obtained in a higher proportion of soy sauce in the marinades. Among three types of soy sauce， low-pH soy sauce was better at tenderizing bovine biceps brachii.

牛肱二頭肌富含膠原蛋白，與其他部位相比肉質(zhì)較硬、嫩度較差[1-2]。肉的嫩度是影響口感的最重要因素之一，影響肉嫩度的因素有很多，包括極限pH值[3]、胴體的冷卻溫度[4]以及膠原組織的含量和溶解度[5-6]。目前，國內(nèi)外用于改善肉嫩度最常用的方法有酶法、機(jī)械法和化學(xué)法，這些嫩化方法不會改變?nèi)獾脑酗L(fēng)味。而日常工藝中的腌制可以在改變?nèi)怙L(fēng)味的同時起到嫩化作用。Oreskovich[7]、Whipple[8]等發(fā)現(xiàn)腌制液中的鹽類及有機(jī)酸類可以增強(qiáng)肉的嫩度，其嫩化機(jī)理存在3 種可能：首先是pH值對肌肉蛋白溶解度的影響，導(dǎo)致肌肉或結(jié)締組織的腫脹[9];其次是腌制液中添加的鈣鹽影響肌肉組織的“鈣泵”或磷酸鹽以提高肌肉持水能力使肉變軟[8];最后是腌制液中可能含有有助于肌肉蛋白水解的酶[10]。

醬油以豆、麥、麩皮和食鹽為原料釀造而成，是我國的傳統(tǒng)調(diào)味品。根據(jù)國標(biāo)可分為釀造醬油（GB 18186—2000《釀造醬油》）和配制醬油（SB 10336—2000《配制醬油》），根據(jù)顏色可分為生抽和老抽，根據(jù)氨基酸態(tài)氮的含量又可分為特級、一級、二級和三級。醬油中含有大量的鹽、游離氨基酸、碳水化合物、肽、有機(jī)酸、礦物質(zhì)以及酯類、醇類和醛酮類等呈味物質(zhì)。Choi[11]、Lee[12]等的研究表明，醬油在發(fā)酵過程中會生成大量的有機(jī)酸，包括乙酸、乳酸、琥珀酸和焦谷氨酸等。Kim等[13]的研究表明，韓國的釀造醬油對肉具有一定的嫩化作用，并和醬油的發(fā)酵過程有關(guān)。雖然已知醬油對肉具有嫩化作用，但關(guān)于國內(nèi)醬油對肉品嫩化特性影響的研究報道很少。為研究我國醬油對肉嫩化特性的影響，選取3 種不同品牌的特級生抽釀造醬油，分別從肉樣pH值、剪切力、膠原蛋白含量、肌節(jié)長度及肌原纖維碎裂指數(shù)（myofibrillar fragmentation index，MFI）等指標(biāo)探究醬油對牛肱二頭肌的嫩化作用，比較3 種醬油添加水平不同時對肉的嫩化效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肱二頭?。ㄌ蕴诎谆膛?，6 歲齡，宰后56 h）;味極鮮特級生抽釀造醬油（X）、美味鮮特級生抽釀造醬油（Y）、一品鮮特級生抽釀造醬油（Z）（X、Y、Z分別代表不同品牌） 新瑪特超市。

氯化鈉、氯化鉀（分析純） 天津市鼎盛鑫化工有限公司;鹽酸、戊二醛、K2HPO4、乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（glycol-bis-（2-aminoethylether）-N，N，N，N-tetraacetic acid，EGTA）、MgCl2、NaN3（優(yōu)級純） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

M200 PRO多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司;pH STAR直測儀 德國Matthaus公司;KP-21C求積儀?日本Koizumi公司;TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀 英國Smsta公司;specord 210 plus紫外分光光度計、移液槍 德國Eppendorf公司;PS-1064-10氦氖激光衍射器 美國Photonics Industries公司;96 孔板、MAK008羥脯氨酸測定試劑盒 美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理及分組

剔除肱二頭肌表面多余筋膜與脂肪，垂直于肌纖維方向切片（厚度約為2.5 cm），然后從每片肉的中心切出4 個2.5 cm見方的肉塊（盡量保證每塊肉上肉眼可見的結(jié)締組織含量接近），每個肉塊質(zhì)量約17 g，一共切出240 個小肉塊，隨機(jī)分配給1 個對照組和9 個處理組（每組24 塊）。

腌制液的配制：根據(jù)醬油標(biāo)簽上的鈉含量計算醬油的鹽含量，用pH計測量醬油的pH值。X醬油的鹽含量為20.10%，pH值為4.98;Y醬油的鹽含量為19.81%，pH值為5.12;Z醬油的鹽含量為19.92%，pH值為5.06。為了控制醬油在腌制液中的添加量（腌制液的鹽含量需維持在3%），需要將3 種醬油稀釋到質(zhì)量濃度15 g/100 mL后再與3 g/100 mL的食鹽溶液按不同比例進(jìn)行混配分組，分為1 個對照組和9 個處理組，一共10 組，腌制液配比及分組如表1所示。

1.3.2 pH值測定

1.3.3 持水力測定

參照Grau等[14]的測定方法。稱取300 mg肉樣置于Whatman No.2濾紙的中心，在36 kg/cm2的力下壓制3 min。使用求積儀測量水圈和肉餅圈的面積，按照公式（1）計算持水力（water holding capacity，WHC）。

1.3.4 剪切力測定

將肉樣放入自制聚乙烯袋中，80 ℃水浴加熱，待中心溫度達(dá)到80 ℃時保持30 min，然后取出冷卻至室溫。用直徑1 cm的中空取樣器沿肌纖維方向取樣，使用TA-XT2i質(zhì)構(gòu)分析儀，選擇附件TA.XTC測定剪切力，測定速率設(shè)定為2 mm/s。

1.3.5 膠原蛋白含量測定

根據(jù)Christensen等[15]的方法測定總膠原蛋白含量及可溶性膠原蛋白含量。為測定總膠原蛋白含量，將取自每個肌肉中心的1 g樣品在10 mL蒸餾水中均質(zhì)，然后加入10 mL 37%鹽酸，混勻;將其在120 ℃條件下溫育3 h，以確保蛋白質(zhì)完全水解;水解后，使用Whatman 1號濾紙過濾樣品以除去顆粒;將來自每個樣品的10 μL濾液轉(zhuǎn)移到96孔微量培養(yǎng)板中，在60 ℃條件下蒸發(fā)過夜。

可溶性膠原蛋白含量測定：從總膠原蛋白含量相同的初始樣品中取第2個1 g樣品，將其置于10 mL 0.3%氯化鈉溶液中，并在90 ℃條件下溫育2 h;將樣品在9 000～10 000 r/min條件下均質(zhì)約30 s，然后在室溫條件下4 500×g離心12 min;用移液槍取500 μL上清液，加入500 μL 37%鹽酸，混勻，在120 ℃條件下溫育3 h，再將其轉(zhuǎn)移至96孔微量培養(yǎng)板，并在60 ℃條件下蒸發(fā)過夜。

一旦孔中的內(nèi)容物蒸發(fā)，使用羥脯氨酸測定試劑盒測定每個孔的羥脯氨酸含量，使用酶標(biāo)儀測定560 nm波長處的吸光度。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線將該吸光度轉(zhuǎn)換為羥脯氨酸含量，乘以7.14得到膠原蛋白含量。

1.3.6 肌節(jié)長度測定

參照Voyle[16]的方法。取1～2 g肉樣，放入2%戊二醛溶液中浸泡30 min，用尖頭鑷子撕開肉樣肌纖維，置于玻璃載片上，然后使用氦氖激光衍射器，通過光學(xué)衍射測量。按照公式（2）計算肌節(jié)長度。

1.3.7 MFI測定

參照李晶晶[17]的方法，測定肉樣的MFI。取待測牛肉樣品4 g，去除脂肪和結(jié)締組織后放入100 mL離心管中，加40 mL預(yù)冷（2 ℃）的MFI緩沖液（含100 mmol/L?KCl、11.2 mmol/L K2HPO4、8.8 mmol/L KH2PO4、1 mmol/L EGTA、1 mmol/L MgCl2及1 mmol/L NaN3），于冰浴中均質(zhì)30 s（10 000 r/min）冷卻20 s，重復(fù)3 次;均質(zhì)后在2 ℃、1 000×g條件下離心15 min，棄去上清液，加入5 倍體積的MFI緩沖液將沉淀懸浮，懸浮液用18 目聚乙烯濾網(wǎng)過濾，除去結(jié)締組織，濾液利用Bradford法測定蛋白濃度;將懸浮液的質(zhì)量濃度調(diào)整到0.5 mg/mL，然后在540 nm波長處測定其吸光度（A540 nm），按照公式（3）計算MFI。

1.3.8 感官評定

先將各組腌制完成的肉樣取出3 塊，置于沸水浴中3 min焯掉血沫，然后分別置于（82±2） ℃水浴中煮制90 min;冷卻至室溫（20 ℃）后，由15 名感官評定人員（6 名男性，9 名女性）對肉樣的嫩度、多汁性、風(fēng)味及綜合評分進(jìn)行10 分制評定。肉樣的感官評定標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個指標(biāo)測定3 個平行樣，每個平行樣重復(fù)測定3 次。采用SPSS 20.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，包括方差分析（analysis of variance，ANOVA）和Ducans顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬油種類及添加量對牛肱二頭肌pH值和WHC的影響

由表3可知：對照組與腌制組肉樣的WHC無顯著差異（P>0.05），這可能與腌制液的鹽含量相同有關(guān)（各組腌制液的食鹽質(zhì)量濃度均控制在3 g/100 mL）;而肉樣的pH值受醬油種類及添加量的影響。由于醬油發(fā)酵過程中有機(jī)酸的形成，導(dǎo)致醬油具有較低的pH值。經(jīng)過72 h的腌制后，肉樣pH值的主要貢獻(xiàn)者是腌制液而不是肉本身。因此，肉樣pH值隨醬油添加量的增加而顯著降低（P<0.05），在同一添加比例條件下，X組肉樣的pH值顯著低于Y組與Z組（P<0.05），其中Y組肉樣pH值最高，這是由于自然發(fā)酵是個不可控的過程，生成有機(jī)酸的量與種類也不可控[9]，因此3 種醬油pH值的差異較大（X：4.98、Y：5.12、Z：5.06），導(dǎo)致各組腌制液的pH值具有顯著差異。

肉的pH值是影響肉嫩度的重要因素，pH值為肌肉蛋白的等電點(diǎn)（5.02）時，肽鍵間的靜電結(jié)合與氫鍵結(jié)合增強(qiáng)，蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)縮緊，肉的嫩度變差;只要pH值高于或低于等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)的實(shí)效電荷增加，增大肽鍵間的排斥力，肉嫩度增加[18]。Oreskovich等[7]的研究表明，腌制液的pH值與肉的WHC有直接影響，pH值高于或低于等電點(diǎn)時，腌制肉內(nèi)保留大量的水分，導(dǎo)致肉的嫩度增加。然而，本研究中所有肉樣的pH值均高于等電點(diǎn)，均具有較好的持水能力，WHC的平均值也隨pH值的增加具有逐漸升高的趨勢，但在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異。

2.2 醬油種類及添加量對牛肱二頭肌剪切力的影響

由表4可知：隨著添加X、Y、Z 3 種醬油的腌制液中醬油含量的增加，肉樣的剪切力顯著降低（P<0.05），肉質(zhì)更嫩;與對照組相比，X1、Y1、Z1組肉樣剪切力的平均值更低，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），而X2、Y2、Z2和X3、Y3、Z3組肉樣的剪切力顯著降低

（P<0.05）。這與Aktas[19]、Andrés-Bello[20]、Decker[21]等的研究結(jié)果一致，即當(dāng)pH值遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時，腌制液的pH值越低，肉的剪切力越低。此外，X2和Z2組肉樣的剪切力顯著低于Y2組，X3組肉樣的剪切力顯著低于Y3組，說明當(dāng)腌制液中醬油的占比升高后，在同一醬油添加水平下，醬油品牌對肉樣剪切力具有顯著影響（P<0.05），其中使用X醬油配制的腌制液對肱二頭肌的嫩化作用最好。

2.3 醬油種類及添加量對牛肱二頭肌膠原蛋白含量的影響

膠原蛋白是一種重要的肌肉組織成分，在維持肌肉結(jié)構(gòu)、柔韌性、強(qiáng)度和肌肉質(zhì)地等方面起著重要作用[6，22]。有研究表明，膠原蛋白含量與肉的嫩度呈負(fù)相關(guān)，而可溶性膠原蛋白含量與肉的嫩度呈正相關(guān)[23-24]。

2.4 醬油種類及添加量對牛肱二頭肌肌節(jié)長度的影響

肌節(jié)長度是反映嫩度的指標(biāo)之一。Hwang[26]、Marcos[27]等指出，當(dāng)肉成熟后肌原纖維蛋白水解緩慢，肌節(jié)長度是肉剪切力的重要決定因素，肌節(jié)長度越短，剪切力越小，肉的嫩度越好。

2.5 醬油種類及添加量對牛肱二頭肌MFI的影響

2.6 醬油種類及添加量對牛肱二頭肌感官評分的影響

由表5可知，腌制液中的醬油種類及添加量對肉樣的嫩度、多汁性及綜合評分具有顯著影響（P<0.05）。腌制液中添加醬油的9 組肉樣的風(fēng)味評分均顯著高于對照組（P<0.05），但各組之間無顯著差異（P>0.05），沒有出現(xiàn)腌制液中醬油含量過高可能會對風(fēng)味產(chǎn)生負(fù)面影響的結(jié)果，這可能與實(shí)驗(yàn)采用的煮制烹飪方式有關(guān)。肉樣嫩度的評分情況與2.2節(jié)中剪切力的變化情況在一定程度上相對應(yīng)，當(dāng)腌制液中醬油稀釋液的占比超過40%時，肉樣的嫩度評分顯著高于對照組、X1、Y1和Z1組（P<0.05），其中X3組肉樣的嫩度評分最高，平均值達(dá)9.48 分，說明醬油對牛肉的嫩化作用不僅體現(xiàn)在硬性指標(biāo)上，在人的主觀感受上也會有較為明顯的察覺。值得注意的是，2.1節(jié)的結(jié)果表明，醬油種類及添加量對肉樣的WHC無顯著影響（P>0.05），而肉樣經(jīng)過煮制之后，醬油的種類及添加量對肉樣的多汁性具有顯著影響（P<0.05），腌制液中醬油含量的增加可顯著提高肉樣的多汁性，而且在X、Y、Z 3 種醬油中X醬油的積極作用更明顯。此外，根據(jù)綜合評分可知，X3、Z3 2 組腌制肉樣的總體可接受度更好。

3 結(jié) 論

由于各組腌制液的pH值具有顯著差異，導(dǎo)致肉樣在浸泡72 h后的pH值同樣差異顯著（P<0.05）。在醬油種類不變的條件下，隨著腌制液中的醬油添加量的增加，肉樣的pH值顯著降低，但對WHC和總膠原蛋白含量無顯著影響（P>0.05）;隨著pH值的降低，肉樣的可溶性蛋白含量顯著增加、肌節(jié)長度顯著變短、MFI顯著升高，進(jìn)而使肉樣的剪切力顯著降低，肉質(zhì)更嫩;而在X、Y、Z 3 種醬油中X醬油的pH值最低（4.98），因此在相同添加量條件下，使用含X醬油腌制液腌制出的肉樣具有更好的嫩度，肉樣嫩度和多汁性的感官評分更高，但pH值與肌節(jié)長度間的相互作用還需深入研究。

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