微生物亞硝化抑制劑對紅腸品質(zhì)的影響

李秀明 常婭妮 吳晨燕 劉靜靜

摘 要：經(jīng)前期探索篩選得到PRO-MIX5（木糖葡萄球菌+清酒乳桿菌+類植物乳桿菌）菌體碎片（稱為微生物亞硝化抑制劑（ microbial nitrification inhibitor，MNI）），MNI在體外模擬體系中能夠抑制N-二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）形成。為驗(yàn)證MNI對紅腸中N-亞硝胺形成的阻斷效果及其相關(guān)品質(zhì)的影響，將MNI按肉質(zhì)量0.05%、0.25%和0.50%的比例添加在腌制后的餡料中，同時(shí)設(shè)置空白對照（control check，CK）組，經(jīng)過拌餡、灌腸、干燥、蒸煮、煙熏及烘烤工序制得紅腸。通過測定紅腸的感官、pH值、紅度值、彈性、亞硝酸鹽含量、生物胺含量及N-亞硝胺含量等指標(biāo)，探究MNI對紅腸產(chǎn)品的感官及安全品質(zhì)的影響。結(jié)果表明：與CK組相比，添加0.05% MNI的紅腸中亞硝酸鹽殘留量為21.44 mg/kg，對亞硝酸鹽降解率達(dá)18.92%，對9 種N-亞硝胺總量的抑制率達(dá)41.04%，其中對NDMA的抑制率高達(dá)52.87%，此時(shí)紅腸的感官評價(jià)分值最高（26 分），紅腸的pH值、紅度值、彈性與CK組無顯著差異，但8 種生物胺總含量比CK組高19.64%，但沒有超過相關(guān)規(guī)定的限量范圍。

關(guān)鍵詞：PRO-MIX5菌體碎片;紅腸;感官品質(zhì);亞硝酸鹽;生物胺;N-亞硝胺

中圖分類號：TS201.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2019）02-0013-06

Abstract： In our previous study， we have found that PRO-MIX5 namely mixed cell debris of Staphylococcus xylosus， Lactobacillus sake and Lactobacillus plantarum as a microbial nitrification inhibitor （MNI） could inhibit the formation of N-dimethylnitrosamine （NDMA） in in vitro model system. In this study， in order to evaluate the blocking effect of MNI on N-nitrosamine in red sausage and its effect on quality attributes， MNI was added to red sausage in mass proportions of 0.05% （group 1）， 0.25% （group 2） and 0.50% （group 3）. At the same time， a blank control group was set up. Red sausage was prepared through marination， filling， drying， steaming， smoking and roasting. The sensory quality， pH value， redness value （a*）， elasticity， nitrite content， biogenic amine content and N-nitrosamine content were measured to understand the effect of MNI on the sensory quality and safety of sausage products. The results showed that the residual nitrite content in the sausage with 0.05% MNI was 21.44 mg/kg， with a degradation rate of 18.92% compared with the control group. The inhibition rate of nine N-nitrosamines was 41.04%， and the inhibition rate of NDMA was 52.87% upon the addition of 0.05% MNI. Moreover， the sensory evaluation score was the highest （26 points）. There was no significant difference in pH value， redness value or elasticity between this group and the control group. However， the total content of eight biogenic amines was 19.64% higher than that in the control group， but it did not exceed the maximum limit.

在紅腸的制作過程中經(jīng)常會(huì)添加亞硝酸鹽，以起到發(fā)色、抑菌、抗氧化和提高風(fēng)味的作用[1]，但是亞硝酸根離子在微酸性環(huán)境中并不穩(wěn)定，所生成的氮氧化物會(huì)與蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物二級胺類物質(zhì)結(jié)合，形成強(qiáng)致癌物N-亞硝胺[2]。紅腸中蛋白質(zhì)含量較高，為N-亞硝胺的形成提供了充足的前體物，且加工溫度及微酸環(huán)境均為N-亞硝胺提供了良好的形成環(huán)境[3]。因此，如何控制產(chǎn)品中N-亞硝胺的形成具有十分重要的意義。目前，有許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵可降解亞硝酸鹽[4-5]，如腸膜明串球菌、植物乳桿菌等[6]，其主要機(jī)理為酸降解、產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶降解或抑制產(chǎn)硝酸鹽還原菌生長[7];乳酸菌發(fā)酵亦能減少N-亞硝胺的前體物，即生物胺的形成[8]，如植物乳桿菌、彎曲乳桿菌等[9]，但存在降解率低、效果不明顯的情況，目前認(rèn)為其降解生物胺的機(jī)理主要是生物胺氧化酶的作用[10]，亦或是抑制產(chǎn)生物胺較多的腐敗微生物的生長。也有研究表明一些乳酸菌，如彎曲乳桿菌，能夠抑制發(fā)酵風(fēng)干腸中N-亞硝胺的形成[11]，其降解機(jī)理可能是乳酸菌的吸附或降解作用[12]，或者是在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了一些能夠降解N-亞硝胺等有害物質(zhì)的酶[13]。

亦有學(xué)者研究得到，戊糖乳桿菌對N-二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）和N-二乙基亞硝胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）起到降解作用的可能是細(xì)胞碎片上的蛋白類物質(zhì)[14]，但目前這些研究結(jié)果主要針對于發(fā)酵類產(chǎn)品[15]，對于無發(fā)酵工藝的產(chǎn)品則不太適用，存在破壞產(chǎn)品原有風(fēng)味、延長加工時(shí)間、所需制作環(huán)境要求高等弊端，并不適合實(shí)際應(yīng)用。經(jīng)過前期實(shí)驗(yàn)的不斷探索得到，乳酸菌發(fā)酵抑制N-亞硝胺形成主要為菌體碎片（稱為微生物亞硝化抑制劑（microbial nitrification inhibitor，MNI））的作用，且篩選得到利用商業(yè)發(fā)酵劑PRO-MIX5（木糖葡萄球菌+清酒乳桿菌+類植物乳桿菌）所制得的菌體碎片在體外模擬體系中對NDMA抑制效果最好。

基于以上研究現(xiàn)狀，將MNI分別以0%、0.05%、0.25%、0.50%比例（以原料肉質(zhì)量計(jì)）添加入腌制后的肉餡中，灌腸后經(jīng)干燥、蒸煮、煙熏、烘烤制得紅腸成品，測定4 組紅腸的感官評分、pH值、色差、彈性、亞硝酸鹽含量、生物胺含量和N-亞硝胺含量等指標(biāo)，以期為PRO-MIX5菌體碎片在紅腸產(chǎn)品以及肉制品中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持，對于提高肉制品的安全性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬后腿肉、豬肥膘 天津市康寧肉制品有限公司;淀粉、大蒜、雞蛋 天津市紅旗農(nóng)貿(mào)市場;PRO-MIX5（木糖葡萄球菌+清酒乳桿菌+類植物乳桿菌） 意大利薩科公司。

MRS固體培養(yǎng)基 北京索萊寶科技有限公司;二氯甲烷（色譜純）、乙腈、氯化鈉、無水硫酸鈉、硼酸 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;高氯酸、丙酮、丹磺酰氯 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

9 種N-亞硝胺標(biāo)品：NDMA、NDEA、N-甲基乙基亞硝胺（N-nitrosomethylethylamine，NMEA）、N-二丁基亞硝胺（N-nitrosodibutylamide，NDBA）、N-二丙基亞硝胺（N-nitrosodipropylamine，NDPA）、N-亞硝基哌啶（N-nitrosopiperidine，NPIP）、N-亞硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-亞硝基嗎啉（N-nitrosomorpholine，NMOR）、N-亞硝基二苯胺（N-nitrosodiphenylamine，NDPheA） 美國Supelco公司;8 種生物胺標(biāo)品：色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、精胺及亞精胺 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A氣相色譜儀（配備氮磷檢測器）和1200高效液相色譜儀（配備紫外吸收檢測器） 美國安捷倫公司;PB-10酸度計(jì) 德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;DW-5120低溫泵 上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;ZXSD-B1090恒溫培養(yǎng)箱 上海博訊儀器設(shè)備有限公司;LLJ-A10T1攪拌機(jī) 廣東小熊電器有限公司;HS07-314恒溫水浴鍋 天津華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;BJRJ-82絞肉機(jī)、BVBJ-30F真空攪拌機(jī)、BYXX-50煙熏爐 浙江嘉興艾博實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MNI的提取

使用添加N-亞硝胺標(biāo)品（作為誘導(dǎo)劑促進(jìn)抑制N-亞硝胺物質(zhì)的形成）質(zhì)量濃度為0.04 μg/mL的MRS肉湯培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)PRO-MIX5混合菌（35 ℃培養(yǎng)至OD600 nm=1.8～2.4），經(jīng)5 000×g、4 ℃離心15 min，棄去上清液得到菌體;用25 mmol/L、pH 6的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）5 000×g、4 ℃離心15 min，沖洗菌體2 次，再以該P(yáng)BS以1∶4（m/V）的比例稀釋菌體，添加終質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶菌酶作用（30 ℃作用2 h，以破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)）后，用超聲波破碎儀以200 W功率，超聲2 s、停2 s，共5 min;經(jīng)10 000×g、4 ℃離心10 min得到的沉淀即為MNI（含水量83.13%）。

1.3.2 紅腸的制作

腌制：以400 g豬后腿肉為例，添加料酒10 g、食鹽14 g、葡萄糖2 g、白砂糖2 g、復(fù)合磷酸鹽2 g、抗壞血酸鈉0.275 g、亞硝酸鈉0.075 g、水20 mL，于4 ℃冰箱中腌制20 h。

拌餡、灌腸：向腌好的肉中加入肥膘100 g、淀粉40 g、蒜泥10 g、白胡椒粉1.2 g、雞蛋40 g、冰水80 g，用真空攪拌機(jī)充分拌勻后灌腸。

熟制：將灌好的腸經(jīng)溫水漂洗、排氣后于煙熏爐中熟制;熟制參數(shù)：干燥：70 ℃、60 min，蒸煮：85 ℃、60 min，煙熏：85 ℃、60 min，烘烤：75 ℃、60 min。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)方案

將MNI分別按肉質(zhì)量的0.05%（1組）、0.25%

（2組）和0.50%（3組）比例添加入腌制后的肉餡中，經(jīng)拌餡、灌腸、熟制得到紅腸產(chǎn)品，同時(shí)將未添加MNI的紅腸產(chǎn)品設(shè)置為空白對照（control check，CK）組，測定產(chǎn)品的感官評分、pH值、紅度值、彈性、亞硝酸鹽含量、8 種生物胺含量及9 種N-亞硝胺含量，分析添加不同比例的MNI對紅腸感官及安全品質(zhì)的影響。

1.3.4 指標(biāo)測定

1.3.4.1 感官評定

1.3.4.2 pH值測定

參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測定》[16]。

1.3.4.3 色差測定

將紅腸中的白色肥膘剔除，剩余部分剁碎，用色差儀測定。

1.3.4.4 彈性測定

將紅腸切成1 cm見方的小正方體，使用質(zhì)構(gòu)儀的P-35探頭測定彈性，具體測定參數(shù)為：測前速率1 mm/s，測中速率1 mm/s，測后速率1 mm/s，位移距離5 mm，位移時(shí)間5 s，觸發(fā)力5 g。

1.3.4.5 亞硝酸鹽含量測定

參照GB 5009.33—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》[17]測定亞硝酸鹽殘留量。

1.3.4.6 生物胺含量測定

參照杜智慧[18]的方法，測定樣品中的8 種生物胺：色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、精胺及亞精胺。

1.3.4.7 N-亞硝胺含量測定

參照GB 5009.26—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中N-亞硝胺類化合物的測定》[19]對樣品中的N-亞硝胺進(jìn)行提取、萃取凈化、濃縮后過濾膜（0.45 μm）。氣相色譜條件：不分流進(jìn)樣量1 μL;進(jìn)樣口溫度250 ℃;柱箱升溫梯度：50 ℃保持4 min，10 ℃/min升至180 ℃保持2 min，20 ℃/min升至220 ℃保持10 min，后運(yùn)行以235 ℃保持2 min;氮磷檢測器溫度330 ℃;氫氣流速2 mL/min，空氣流速60 mL/min，載氣（N2）流速6 mL/min。過濾膜后的樣品用上述氣相色譜條件測定9 種N-亞硝胺含量，同時(shí)進(jìn)行外標(biāo)法分析定量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用Statistix 8.1軟件進(jìn)行顯著性分析，SigmaPlot 10.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同MNI添加量對紅腸感官品質(zhì)的影響

由表2可知：組1紅腸的風(fēng)味和滋味最佳，整體可接受程度較高，其總分甚至高于CK組，說明加入適量菌體碎片后，不僅不會(huì)影響口感，反而能夠提高紅腸產(chǎn)品的風(fēng)味，增加其可接受度;而組2和組3紅腸的感官評分均低于CK組，表現(xiàn)在氣味和滋味評分明顯較低，這是由于所添加的MNI偏酸性（pH值為6），添加量高會(huì)使產(chǎn)品口感偏酸，因此降低了品評者對產(chǎn)品的接受度。

2.2 不同MNI添加量對紅腸pH值的影響

2.3 不同MNI添加量對紅腸紅度值和彈性的影響

2.4 不同MNI添加量對紅腸中亞硝酸鹽的影響

由圖4可知，隨著MNI添加量的增加，紅腸中的亞硝酸鹽殘留量顯著降低，各組之間差異達(dá)顯著水平（P<0.05）。3 種添加量MNI對紅腸中亞硝酸鹽的降解率分別為18.92%、37.83%、51.19%，說明MNI具有降低亞硝酸鹽殘留量的效果，且降解效果與其添加量呈正比。結(jié)合pH值變化情況分析，這可能是由于酸性作用促進(jìn)了亞硝酸鹽的降解。但張慶芳等[20]的研究表明，當(dāng)pH<4.5時(shí)，亞硝酸鹽的降解主要是由于酸作用;當(dāng)pH>4.5時(shí)，主要是由于酶作用，本研究各組紅腸產(chǎn)品的pH值均在5.9以上，說明MNI中可能含有除酸以外的具有降解亞硝酸鹽作用的物質(zhì)，菌體碎片中主要包含細(xì)胞壁碎片、細(xì)胞膜碎片、細(xì)胞器及包涵體等物質(zhì)，應(yīng)用時(shí)在餡料中添加該菌體碎片混勻后直接灌腸熟制，說明可能并不是一些活性酶的作用，其對亞硝酸鹽起到降解作用的機(jī)理仍有待深入研究。

2.5 不同MNI添加量對紅腸中生物胺的影響

生物胺是一類脂肪族、芳香族或雜環(huán)類低分子含氮化合物，主要由微生物作用于蛋白質(zhì)使其降解為氨基酸，再由氨基酸脫羧反應(yīng)生成[21]。

由表3可知，添加MNI后，紅腸產(chǎn)品中產(chǎn)生了色胺和組胺，且一些其他胺類含量有所增加。本研究所添加的MNI中含有細(xì)胞膜、核酸等物質(zhì)，由于生物胺在調(diào)節(jié)DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成及生物膜穩(wěn)定性方面均有重要作用[22]，且測得MNI中8 種生物胺的含量（表4），說明添加MNI后紅腸中生物胺含量增加可能是由MNI外源攜帶導(dǎo)致，亦可能是所添加MNI的微酸性促進(jìn)了一些微生物的氨基酸脫羧酶活性[23]。常見的生物胺中以組胺毒性最大，其次是酪胺[24]。3 種MNI添加量均能顯著降低酪胺的形成量，且3 組之間差異不顯著（P>0.05）。綜合來看，MNI添加量較低的組1（0.05%）所含生物胺的量相對較少，安全性較高。目前針對紅腸中的生物胺含量并無限量標(biāo)準(zhǔn)，但根據(jù)一些相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，如歐盟規(guī)定食品中組胺和酪胺含量分別不得超過100、100～800 mg/kg，國內(nèi)僅在上海地方標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定發(fā)酵肉制品中組胺含量不得超過100 mg/kg[25]。本研究添加MNI后各組紅腸中的組胺和酪胺含量遠(yuǎn)低于這些相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，不會(huì)對人體造成危害。

2.6 不同MNI添加量對紅腸中9 種N-亞硝胺形成的影響

由于NDMA存在于較多食品中，且毒性較大，國標(biāo)中僅規(guī)定NDMA含量不得超過3 μg/kg[26]。由表5可知：MNI添加量為0.05%（組1）和0.50%（組3）能夠顯著抑制紅腸中NDMA的形成，抑制率可達(dá)52.87%～63.60%，抑制效果明顯，而組2（MNI添加量0.25%）的NDMA形成量與CK組差異不顯著（P>0.05）;3 種MNI添加量均能顯著降低紅腸產(chǎn)品中9 種N-亞硝胺的總量，其中以MNI添加量為0.05%（組1）的抑制效果最佳，此時(shí)對NDMA、NMEA、NPIP、NMOR和NDPheA的抑制效果均十分顯著，對9 種N-亞硝胺總量的抑制率可達(dá)41.04%，MNI添加量為0.25%（組2）和0.50%（組3）對應(yīng)的抑制率分別為16.13%和13.48%，二者抑制效果差異不顯著（P>0.05）。說明適量添加MNI能夠顯著抑制N-亞硝胺的形成，提高紅腸產(chǎn)品的安全性，應(yīng)用效果良好。這可能是由于菌體碎片對N-亞硝胺具有一定的吸附作用[12，27]，也可能是由于菌體碎片混合物中含有某些能夠阻斷N-亞硝胺形成的物質(zhì)，其具體機(jī)理仍有待進(jìn)一步深入研究。但根據(jù)檢測結(jié)果可以看出，MNI的添加對NDMA的抑制并沒有規(guī)律性，因此本研究需要進(jìn)一步確定MNI的添加量和NDMA抑制率之間的關(guān)系。

3 討 論

經(jīng)過以上對感官及安全品質(zhì)各項(xiàng)指標(biāo)的分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PRO-MIX5乳酸菌菌體碎片添加量較大時(shí)，紅腸會(huì)產(chǎn)生略酸的口感，但整體來看MNI的添加對紅腸的pH值、紅度值和彈性影響并不大，甚至適量添加后可提高產(chǎn)品的風(fēng)味;更重要的是可以起到降解亞硝酸鹽及抑制

N-亞硝胺形成的作用，提高紅腸的安全品質(zhì)，雖然會(huì)增加某些生物胺（色胺和組胺）的含量，但其含量相對較低，并不會(huì)對人體造成危害[28]，且生物胺是人體必不可少的物質(zhì)，如色胺可調(diào)節(jié)血壓[29]，組胺具有參與局部免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)腸道生理功能、調(diào)節(jié)白血細(xì)胞和一些蛋白質(zhì)的數(shù)量等生理功能[30]。且作為N-亞硝胺形成的前體物質(zhì)，胺類物質(zhì)含量增加，但N-亞硝胺含量降低，其原因可能是MNI的添加抑制了胺類物質(zhì)和氮氧化物結(jié)合形成N-亞硝胺，從而使得前體物蓄積?？傮w來看，添加MNI可在不影響口感的同時(shí)提高紅腸產(chǎn)品的安全性，且在較低添加量下就能起到明顯作用，對于其具體的作用機(jī)理和發(fā)揮作用的有效物質(zhì)還需進(jìn)一步深入研究，有針對性地獲得能夠提高產(chǎn)品品質(zhì)和安全的靶向物質(zhì)，以期制成可以在肉制品加工中應(yīng)用的有效MNI，并將其商品化，更加廣泛地應(yīng)用。

4 結(jié) 論

添加不同比例的MNI對紅腸品質(zhì)變化的各項(xiàng)指標(biāo)分析結(jié)果表明：與CK組相比，添加0.05%的PRO-MIX5菌體碎片可顯著提高紅腸的風(fēng)味，亞硝酸鹽降解率達(dá)18.9%，對NDMA的抑制率達(dá)52.87%，對9 種N-亞硝胺總量的抑制率達(dá)41.04%，而對產(chǎn)品的pH值、紅度值和彈性影響不顯著;雖然生物胺含量略有增加，但其形成量遠(yuǎn)低于相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定?？傮w而言，MNI的添加可顯著提高紅腸產(chǎn)品的安全品質(zhì)，有望在肉制品中加以應(yīng)用。

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