植物生長調(diào)節(jié)劑對納塔櫟插穗生根及其生理生化特性的影響

陳 晨 吳岐奎 張子晗 喻方圓 吳 文 姚忠賢

( 1. 南京林業(yè)大學林學院, 江蘇 南京 210037；2. 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；3. 上海市林業(yè)總站，上海 200040；4. 上海君冠花木種植專業(yè)合作社，上海 201500)

納塔櫟（Quercus nuttallii），殼斗科（Fagaceae）櫟屬（Quercus）落葉喬木。納塔櫟原產(chǎn)美國，在佛羅里達西部至德克薩斯東南部沿海平原低洼地分布較廣。我國自19世紀末20世紀初大量引種櫟樹[1]，其中納塔櫟在浙江、上海、江蘇等地引種后生長良好，適應性強，引種前景廣闊[2]。前人對納塔櫟種質(zhì)資源的引進、收集，以及抗逆性等已經(jīng)有了較多研究[3]。15年生納塔櫟在每年10月中旬至2月中旬淹水的情況下，仍有89%的存活率[4]；Stanturf等在對美國密西西比河地區(qū)樹種劃分耐澇級別時將納塔櫟劃分為中等耐水級[5]。姜琳等通過測定凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導度等光合參數(shù)研究3種不同葉色櫟樹，即納塔櫟（Q. nuttallii）、鮮紅櫟（Q. coccinea）和加州白櫟（Q. lyrata）光合特性，結果發(fā)現(xiàn)3種櫟樹凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導度日變化夏季呈雙峰曲線，秋季呈單峰曲線[6]。櫟類樹種體內(nèi)含有生根抑制物質(zhì)，如單寧、酚類物質(zhì)等，因此屬于扦插難生根樹種[7]。目前納塔櫟主要依靠種子繁殖，而納塔櫟種子價格高、運輸費用貴，種子需低溫沙藏3個月以打破休眠，大規(guī)模育苗的成本比較高。扦插繁殖具有保持母本的優(yōu)良性狀、繁殖周期短等優(yōu)點，而關于納塔櫟無性繁殖的報道很少見。為解決納塔櫟繁殖速度慢、規(guī)模化生產(chǎn)困難等問題，本試驗通過研究不同植物生長調(diào)節(jié)劑處理對納塔櫟插穗生根指標的影響，以及生根過程中生理指標的變化，探討其扦插生根機理，為納塔櫟無性系快繁提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于上海市金山區(qū)楓涇鎮(zhèn)上海君冠花木種植專業(yè)合作社苗圃（東經(jīng)121°9′，北緯 30°54′）。屬北亞熱帶季風氣候，全年平均氣溫16.6 ℃，年平均降雨量1 156.7 mm左右，光照充足。

1.2 插穗的采集與制備

2017年6月24日，選取生長健壯、長勢一致且無病蟲害的2年生納塔櫟母樹采集嫩枝制備插穗，每穗長10～12 cm，保留1個葉1個芽，在形態(tài)學上端1 cm處平剪，形態(tài)學下端0.5 cm處斜剪。

1.3 試驗設計

插穗生根試驗：采用隨機區(qū)組試驗設計，設200 mg/kg ABT、200 mg/kg IAA、200 mg/kg NAA和清水對照4個處理。每處理3個重復，每個重復30根插穗。將剪好的插穗基部分別在不同處理的溶液中浸泡2 h，扦插于珍珠巖中。

插穗生根機理試驗：設200 mg/kg ABT和清水對照2個處理。每處理3個重復，每個重復30根插穗。將剪好的插穗基部分別在不同處理的溶液中浸泡2 h，扦插于珍珠巖中。

1.4 插后管理

扦插后壓實周圍基質(zhì)，株行距控制在5 cm×5 cm左右，全部扦插完一次性澆透水。根據(jù)天氣情況開啟自動噴霧，氣溫較高時增加噴霧頻率，陰雨涼爽時則適當降低頻率。

1.5 測定指標

插穗生根試驗中，扦插60 d后調(diào)查納塔櫟插穗生根情況。調(diào)查指標包括生根率（%）、平均生根數(shù)（條/株）、平均根長（cm）和生根指數(shù)。計算方法如下：

插穗生根機理試驗中，從插后0 d即開始取樣，每隔7 d取一次樣，每次取樣每處理每重復4根，共取樣7次。分別剝?nèi)〔煌幚聿逅牖宽g皮部并混合均勻，于-80 ℃冰箱中保存待測。可溶性糖含量、可溶性蛋白含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性采用李合生[8]的方法測定；過氧化物酶（POD）活性、多酚氧化酶（PPO）活性及丙二醛（MDA）含量采用高俊鳳[9]的方法測定；內(nèi)源激素含量采用酶聯(lián)免疫吸附法測定[10]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Excel 2010整理數(shù)據(jù)及繪圖；利用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件對不同處理間插穗生根指標和生理生化指標的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和多重比較。每個指標數(shù)據(jù)均為3個重復的平均值，結果用平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 不同處理對納塔櫟插穗生根的影響

由表1知，不同植物生長調(diào)節(jié)劑處理均提高了插穗的生根率、平均根數(shù)、根長和生根指數(shù)，與對照達到顯著或極顯著差異水平。200 mg/kg ABT處理的插穗各項生根指標均為最高，與200 mg/kg IAA與200 mg/kg NAA存在顯著差異。而200 mg/kg IAA與200 mg/kg NAA處理差異不顯著。因此，200 mg/kg ABT處理效果最佳。

表 1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對納塔櫟插穗生根率和生根質(zhì)量的影響Table 1 Effects of different plant growth regulators on rooting rate and quality of Q. nuttallii cuttings

2.2 插穗生根過程中營養(yǎng)物質(zhì)含量的變化

由圖1可知，納塔櫟插穗基部可溶性糖含量大致呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢。扦插初期插穗要維持正常生命活動，因此消耗了自身儲存的可溶性糖導致含量下降，而在愈傷組織形成期大幅上升，并在21 d時達到最大值，這為后期插穗生根儲存了碳源；對照組可溶性糖含量在28 d才上升到最大值。21 d后處理組可溶性糖含量開始下降，此時不定根形成，呼吸作用加強，可溶性糖大量消耗以保證能量供應。扦插后期，處理組可溶性糖含量又出現(xiàn)小幅上升，原因是葉片光合作用產(chǎn)生的光合產(chǎn)物向插穗基部運輸減緩了可溶性糖的消耗。28 d后對照組可溶性糖含量下降，可見經(jīng)植物生長調(diào)節(jié)劑處理可以使納塔櫟生根提前7 d左右。

由圖2可知，可溶性蛋白含量在初期有個短暫的積累過程，此時積累一定量的可溶性蛋白對愈傷組織的形成有利。不定根生成后可溶性蛋白逐漸被消耗，此時可溶性蛋白用于不定根的生長以及新細胞的形成。對照組可溶性蛋白變化規(guī)律與處理組大致相同，不過在21 d才開始下降。

2.3 插穗生根過程中相關酶活性及MDA含量的變化

由圖3可知，0～7 d POD活性小幅下降后大幅上升，高活性的POD可以增強離體插穗抗逆性。對照組POD活性變化幅度小于處理組，可見植物生長調(diào)節(jié)劑處理可以顯著加強受損插穗的抗逆性。21～28 d處理組POD活性再次呈現(xiàn)下降趨勢，35 d時處理組POD活性出現(xiàn)第2個峰值，此時高活性POD降低了IAA對生根的抑制作用。此后隨著不定根大量形成，插穗生長趨于穩(wěn)定，POD活性下降。對照組變化規(guī)律相似，幅度較小，說明植物生長調(diào)節(jié)劑處理能顯著改變插穗基部POD活性，對于根系形成有促進作用。

圖 1 插穗生根過程中可溶性糖含量變化Fig. 1 The dynamic changes of soluble sugar content in cuttings during rooting process

圖 2 插穗生根過程中可溶性蛋白含量變化Fig. 2 The dynamic changes of soluble protein content in cuttings during rooting process

圖 3 插穗生根過程中POD活性變化Fig. 3 The dynamic changes of POD activity incuttings during rooting process

由圖4可知，處理組插穗基部PPO活性在14 d達到第1個峰值，此時高活性的PPO有利于愈傷組織的形成。28 d達到第2個峰值，此時不定根大量出現(xiàn)，隨后活性降低。總的來看，經(jīng)植物生長調(diào)節(jié)劑處理的插穗基部PPO活性始終保持在較高水平且高于對照組，這對愈傷組織和不定根的形成有促進作用。

圖 4 插穗生根過程中PPO活性變化Fig. 4 The dynamic changes of PPO activity in cuttings during rooting process

由圖5可知，0～7 d處理組插穗基部SOD活性升高有利于自由基的消除。隨著愈傷組織出現(xiàn)，插穗內(nèi)各種生命活動恢復正常水平，SOD活性降低。14 d后再次上升，伴隨著不定根形成以及葉片的展開，插穗逐漸具備了正常植株的功能，導致自由基大量減少，SOD活性相應降低。對照組SOD活性在14 d后才持續(xù)降低，可見植物生長調(diào)節(jié)劑處理不僅提前了生根時間，對于保護離體插穗免受外界脅迫有著重要作用。

圖 5 插穗生根過程中SOD活性變化Fig. 5 The dynamic changes of SOD activity in cuttings during rooting process

由圖6可知，插穗離體后水分蒸發(fā)較快，受損嚴重，處理組插穗基部MDA含量小幅上升。隨著SOD活性升高，愈傷組織及不定根的形成，插穗內(nèi)MDA含量逐步下降。對照組中，插穗基部韌皮部MDA含量在扦插后14 d開始下降，相比于處理組晚了7 d，但兩組的變化趨勢大致相同?？梢娭参锷L調(diào)節(jié)劑處理的插穗受逆境脅迫程度更小、時間更短。

圖 6 插穗生根過程中MDA含量變化Fig. 6 The dynamic changes of MDA content in cuttings during rooting process

2.4 插穗生根過程中內(nèi)源激素含量的變化

由圖7可知，扦插初期插穗基部GA3含量上升，可能的原因是植物生長調(diào)節(jié)劑的處理提高其含量，14 d達到峰值，說明高含量的GA3對愈傷組織的形成有促進作用。14 d后GA3含量呈下降趨勢，此時不定根形成以及根突破表皮，可見GA3對根原基分化有重要作用。ZR含量經(jīng)歷了短暫的積累后隨著愈傷組織的出現(xiàn)大幅降低，28 d后隨著不定根生成，自身合成了ZR，含量小幅上升。處理組ZR含量始終高于對照組，由此可見植物生長調(diào)節(jié)劑處理可以提高插穗內(nèi)ZR含量。植物生長調(diào)節(jié)劑處理使得0～14 d IAA含量不斷上升，而愈傷組織出現(xiàn)后IAA含量下降。由于不定根的形成自身合成內(nèi)源IAA以及POD活性降低使得21 d后IAA含量再次增加，處理組IAA含量始終高于對照組。通常認為ABA會對插穗生根起抑制作用，將插穗生根過程中ABA濃度控制在較低水平有利于增強IAA的運輸，促進離體器官生長。扦插初期，ABA含量上升，原因是離體插穗受損嚴重，刺激了ABA的合成，而當愈傷組織出現(xiàn)后ABA含量降低；本試驗中處理組插穗基部ABA濃度始終低于對照組。有報道認為IAA/ABA比值與生根率呈正相關；本試驗中，植物生長調(diào)節(jié)劑處理過的插穗IAA/ABA高于對照組，與前人研究一致。

3 結論與討論

3.1 植物生長調(diào)節(jié)劑處理與插穗生根的關系

插穗生根過程中，離體插穗的不定根再生能力與植物生長調(diào)節(jié)劑的處理有很大關系。母樹年齡、樹種特性、生根方式和外界條件等都是選擇植物生長調(diào)節(jié)劑時應該考慮到的要素[11]。本試驗中，200 mg/kg ABT處理插穗生根效果最好，生根率達33.30%，生根指數(shù)為1.693。不同種類植物生長調(diào)節(jié)劑處理納塔櫟嫩枝插穗時，生根效果最好的是ABT，其次為IAA和NAA，可能的原因是不同植物生長調(diào)節(jié)劑對木本植物扦插生根效果影響不同[12]。這與高銀祥等[13]對南方紅豆杉（Taxus chinensisvar.mairei）的扦插研究結果相似。

3.2 營養(yǎng)物質(zhì)含量與插穗生根的關系

營養(yǎng)物質(zhì)尤其是碳水化合物和氮素化合物，為插穗生根和植物正常生長提供物質(zhì)和能量[14-15]。可溶性糖可作為呼吸底物被植物利用，為插穗生根提供能量，是插穗能量的主要來源。本試驗中，扦插初期處理組插穗消耗儲存的可溶性糖維持自身生命活動，導致可溶性糖含量大幅下降，而對照組有個短暫的積累過程才呈現(xiàn)下降趨勢；愈傷組織出現(xiàn)后，基部代謝活躍，可溶性糖含量得到積累；21 d處理組插穗基部可溶性糖被大量消耗以用于不定根形成；扦插后期，處理組可溶性糖含量小幅上升，原因是葉片光合作用產(chǎn)生的光合產(chǎn)物彌補了基部可溶性糖的消耗。馬尾松（Pinus massoniana）的扦插試驗中，插穗基部可溶性糖含量在扦插后先升高，在生根時達到峰值，然后再次下降，該研究結果與本試驗結果不同[16]，可能的原因是取自不同樹種的插穗基部可溶性糖原始含量不同。趙爽等[17]在對山木通（Clematis finetiana）扦插時得出的可溶性糖含量變化與本試驗結果一致。

本試驗中，處理組插穗基部可溶性蛋白先短暫積累后逐漸降低，原因是愈傷組織的出現(xiàn)需要積累可溶性蛋白，而不定根的生長以及新細胞的形成需要消耗可溶性蛋白。對照組可溶性蛋白變化趨勢與處理組一致。張忠微等[18]在金露梅（Potentilla fruticosa）嫩枝插穗生根過程中發(fā)現(xiàn)，可溶性蛋白含量先降低再升高又降低，與本試驗不同，可能的原因是扦插初期傷呼吸加強，代謝旺盛導致可溶性蛋白含量降低，而中期經(jīng)過積累后可溶性蛋白大量消耗用于根原基和不定根的生長。

3.3 相關酶活性及MDA含量與插穗生根的關系

POD是插穗生根標志之一，同時在不定根發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[19-20]。本試驗中，處理組POD活性出現(xiàn)2個峰值。21 d第1個峰值出現(xiàn)，此時插穗離體受損嚴重，高活性的POD增強了插穗的抗逆性；35 d出現(xiàn)第2個峰值，此時高活性POD能夠減少IAA對生根的抑制作用。插穗生根過程中對照組POD活性與處理組相比較低，說明植物生長調(diào)節(jié)劑處理能夠顯著提高POD活性，有效促進根系的形成。扈紅軍等在榛子（Corylus heterophylla）扦插試驗中發(fā)現(xiàn)POD活性僅出現(xiàn)1個峰值，這可能與插穗所受脅迫程度有關[21]。

本試驗中，處理組與對照組PPO活性變化趨勢基本一致，均出現(xiàn)2個峰值。扦插初期PPO活性較高對愈傷組織的形成有利，隨后PPO活性降低。PPO活性第2個峰值出現(xiàn)在不定根大量出現(xiàn)時期。處理組PPO活性始終高于對照組，植物生長調(diào)節(jié)劑處理對愈傷組織和不定根的形成有著促進作用。Yilmaz等在對不同品種葡萄（Vitis vinifera）扦插時也得出此結論[22]。

SOD不僅可以提高植物的抗氧化能力，而且與不定根的形成關系密切[23]。插穗生根初期，高活性的SOD能清除多余的自由基，增強離體插穗的抗逆性；隨著愈傷組織的出現(xiàn)，SOD活性逐漸降低；不定根出現(xiàn)前SOD活性再次升高，有利于起到保護生根的作用；插穗恢復正常植株功能后，體內(nèi)自由基含量減少，SOD活性也逐漸降低。王關林等[24]通過噴灑代謝調(diào)節(jié)劑MHS加強對插穗生理生化的調(diào)控，從而提高了插穗的防御能力，促進生根。

MDA含量不僅可以用來衡量植物受損程度，而且還是鑒別植物發(fā)生衰老的指標之一[25]。納塔櫟嫩枝扦插過程中，MDA含量在扦插初期小幅上升，此時插穗離體，遭受較重傷害；而當SOD活性升高以及不定根大量形成，插穗內(nèi)各項生命活性恢復正常，生長代謝趨于穩(wěn)定，MDA含量逐漸下降。王云麗[26]在對沙棘（Hippophae rhamnoides）扦插時也得到了相同的結論。

3.4 內(nèi)源激素與插穗生根的關系

插穗生根過程中愈傷組織的形成、根原基的誘導以及不定根的形成都與植物內(nèi)源激素的含量以及相互作用密切相關[27]。本試驗中，0～14 d IAA含量升高，原因是植物生長調(diào)節(jié)劑處理插穗后使得IAA含量升高；當愈傷組織出現(xiàn)后IAA含量下降；由于不定根形成之后，插穗自身會合成內(nèi)源IAA，使得內(nèi)源IAA含量再次升高。處理組IAA含量始終高于對照組，與史鋒厚等[28]研究結果一致。普遍認為ABA在生根過程中起抑制作用，納塔櫟嫩枝扦插過程中對照組ABA含量始終高于處理組，這也是對照組生根率較低的原因。麻文俊在日本落葉松（Larix kaempferi）扦插時發(fā)現(xiàn)，IAA含量與扦插生根率并無顯著聯(lián)系，反而是ABA含量與生根率相關性較高[29]。植物器官內(nèi)激素種類眾多，每種激素含量及作用各不相同，植物的各種生理效應取決于某幾種激素的相對含量，而某一種激素的絕對含量影響甚微。本試驗中IAA/ABA值較小，生根率較低，與前人研究結果一致。愈傷組織的形成需要高含量的GA3，而當不定根形成以及根突破表皮，GA3含量大幅下降。董勝君等在研究山杏（Armeniaca sibirica）嫩枝扦插生根過程中插穗內(nèi)源激素含量的變化時發(fā)現(xiàn)，GA3含量總體呈現(xiàn)下降趨勢，在生根階段下降趨勢尤為明顯[30]。ZR含量變化趨勢大致為“上升—下降—上升”，愈傷組織大量出現(xiàn)時ZR含量下降幅度大，而不定根形成后自身合成了ZR。尹萬元在對光葉櫸（Zelkova serrata）進行扦插時，插穗基部ZR含量呈明顯上升趨勢，與生根過程同步[31]。

綜上所述，植物生長調(diào)節(jié)劑處理顯著提高了插穗的生根能力，且處理后的插穗營養(yǎng)物質(zhì)含量、相關酶活性及內(nèi)源激素含量顯著升高。200 mg/kg ABT為納塔櫟最適宜的植物生長調(diào)節(jié)劑處理，該處理可在生產(chǎn)中推廣應用。