載脂蛋白C3轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟免疫細(xì)胞表型及其活性分析

徐 聰，藺志杰，龔衛(wèi)娟，賈筱琴，李國(guó)利，*

(1．揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2．揚(yáng)州大學(xué)護(hù)理學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；3．湖北省襄陽(yáng)市南漳縣中醫(yī)院，湖北 襄陽(yáng)441500)

高甘油三酯血癥與動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖癥、糖尿病、癌癥等多種疾病有關(guān)，而且這些疾病的發(fā)生往往伴隨著體內(nèi)免疫功能的紊亂[1]。因此，研究異常代謝環(huán)境下，免疫細(xì)胞的代謝活性如何被調(diào)控繼而影響其生物學(xué)功能的發(fā)揮，對(duì)深度闡明代謝相關(guān)性疾病、癌癥等疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

載脂蛋白C(apolipoprotein C，Apo C)是肝臟中合成的水溶性的低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，包括4種亞型：Apo C1/2/3/4。Apo C主要存在于乳糜微粒、極低密度脂蛋白和高密度脂蛋白中，在人體脂質(zhì)代謝中起重要的作用。載脂蛋白C3基因位于第11號(hào)染色體11q23.1-q23.2基因簇內(nèi)，全長(zhǎng)約3.1 kb。Apo C3分子主要在肝臟合成，存在于各種脂蛋白中，小腸亦可合成少量。Apo C3主要抑制脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)活性，并且抑制肝臟攝取富含甘油三酯脂蛋白及其殘粒。體內(nèi)異常增高的Apo C3可引起高甘油三酯血癥[2]，Gaudet等[3]研究報(bào)道阻斷Apo C3基因的表達(dá)，可顯著降低甘油三酯的濃度。Apo C3基因多態(tài)性被發(fā)現(xiàn)與動(dòng)脈粥樣硬化[3]、冠心病[4]、胰腺炎[5]、非酒精性脂肪肝[6]、痛風(fēng)[7]和癌癥[8]等多種疾病有關(guān)。高甘油三酯血癥引起的動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、脂肪肝、胰腺炎、癌癥等疾病往往伴有慢性炎癥，與相關(guān)炎癥細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞的異常浸潤(rùn)有關(guān)[9]。目前已有研究表明，Apo C3參與了多種調(diào)節(jié)炎癥和免疫細(xì)胞分化的功能[10]。Apo C3的靶蛋白脂蛋白脂酶LPL主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心臟和骨骼肌等細(xì)胞。Apo C3通過(guò)抑制TRLs分解及影響HDL代謝，激活血管內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞促進(jìn)各種炎癥發(fā)生。血液中Apo C3濃度亦與胰島素抵抗以及胰島β細(xì)胞失活呈正相關(guān)。2006年，Hotamisligil[11]在《Nature》雜志上首次提出了“代謝性炎癥(metaflammation)”的說(shuō)法，使越來(lái)越多的人關(guān)注到代謝與免疫的相互影響。那么Apo C3對(duì)小鼠脾臟免疫細(xì)胞頻率及其抗腫瘤生物活性有何影響。圍繞此問(wèn)題，本課題組引進(jìn)了Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠，基于此模型初步探討Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠的脾臟免疫細(xì)胞表型及活性。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

紅細(xì)胞裂解液、玻璃毛細(xì)管，購(gòu)于杭州碧云天公司；Percp-cy5.5 anti-mouse CD3抗體、APC antimouse CD19抗體、APC anti-mouse CD4抗體、Percp-cy5.5 anti-mouse CD8抗體、PE anti-mouse NKG2D抗體、APC anti-mouse CD11c抗體、FITC anti-mouse NK1.1抗體、APC anti-mouse F4/80抗體、Percp-cy5.5 anti-mouse Gr-1抗體、Percp-cy5.5 anti-mouse CD107a等，購(gòu)于美國(guó)eBioscience公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀，購(gòu)于美國(guó)BD公司；酶標(biāo)儀，購(gòu)于Thermo Infinity公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng) SPF級(jí)ICR小鼠，購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。所有動(dòng)物的健康狀況均滿足國(guó)家規(guī)定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康標(biāo)準(zhǔn)。其中，Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠12只，鼠齡8~10周，雄性；另選鼠齡/性別匹配的野生型ICR雄性小鼠12只，作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)條件為SPF級(jí)。標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，自由飲食飲水。

1.2.2 小鼠血漿甘油三酯(TG)檢測(cè) 為了確定血漿甘油三酯水平，將小鼠禁食16 h并從球后靜脈叢取血100 μL。使用甘油三酯測(cè)定試劑盒以酶反應(yīng)顯色比色法檢測(cè)，使用酶標(biāo)儀測(cè)定血漿甘油三酯水平，具體步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.3 脾臟單細(xì)胞懸液的制備 頸椎脫臼法處死小鼠，置于75%酒精中浸泡5 min。在超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌條件下取脾臟放入60 mm培養(yǎng)皿中，其內(nèi)預(yù)先鋪有一張200目的尼龍濾網(wǎng)并加入3 mL無(wú)菌PBS緩沖液。磨碎脾臟，經(jīng)200目尼龍濾網(wǎng)濾過(guò)并收集至離心管中，4℃離心，1 500 r/min，5 min，棄去上清。加入2 mL商品化的紅細(xì)胞裂解液，吹打均勻后室溫裂解5 min，再加入5 mL無(wú)菌PBS緩沖液終止裂解，離心并棄去上清。3 mL無(wú)菌PBS緩沖液洗滌細(xì)胞一遍后，1 mL無(wú)菌PBS緩沖液重懸細(xì)胞，用200目的尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾，即為制備好的脾臟單細(xì)胞懸液。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟免疫細(xì)胞表型及活性 從脾臟單細(xì)胞懸液中取出50 μL，分裝入無(wú)菌EP管中，加入FITC anti-mouse CD4抗體、PE anti-mouse CD19抗體、PE anti-mouse CD44抗體、APC antimouse CD8抗體等所有要標(biāo)記的抗體，4℃孵育30 min。200 μL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，置于冰上，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，操作時(shí)盡量采取避光處理。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD8+T細(xì)胞表面CD107a表達(dá) 用RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸結(jié)腸癌MC38細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×106/mL，脾臟細(xì)胞作為靶細(xì)胞。將MC38與脾臟單細(xì)胞懸液以1∶1、1∶3、3∶1比例混合，置于U型孔，37℃ CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，加莫能菌素(monensin，2 μmol/L)繼續(xù)孵育 3.5 h 后加 APC anti-mouse CD8抗體、Percp-cy5.5 anti-mouse CD107a避光孵育0.5 h，PBS緩沖液洗滌3次后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6軟件處理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖。應(yīng)用SPASS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用Dunnettt檢驗(yàn)分析轉(zhuǎn)基因(Apo C3)與野生型(WT)小鼠之間的差異，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠體質(zhì)量及血漿甘油三酯的變化情況

雄性Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠和鼠齡/性別匹配的野生型小鼠體質(zhì)量變化無(wú)明顯差異(圖1A)。與野生型小鼠相比，Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠在斷奶后血漿TG濃度顯著升高(圖 1B)。

圖1 Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生高甘油三酯血癥

2.2 檢測(cè)小鼠脾臟免疫細(xì)胞頻率及活性

采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)小鼠脾臟免疫細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示與野生型小鼠相比，Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟CD3+CD8+、CD3+CD8+NKG2D+和 CD3+CD8+CD44+細(xì)胞頻率增多(圖 2)，CD8+CD62L-CD44+、CD8+CD44+KLGR1+頻率升高(圖3)，以效應(yīng)性T細(xì)胞為主，且CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ水平增強(qiáng)(圖4)；脾臟CD3-NK1.1+、CD3-NK1.1+NKG2D+細(xì)胞頻率明顯減少(圖 5)；髓系抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)細(xì)胞頻率增加(圖 6)；脾臟 CD3+CD4+NKG2D+、CD3+CD4+IL-17+細(xì)胞頻率無(wú)明顯變化(圖7)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、NKT細(xì)胞、γδT細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞頻率亦無(wú)明顯變化(圖8~11)。

2.3 Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠CD8+T細(xì)胞活化后CD107a表達(dá)水平

流式細(xì)胞術(shù)分析CD8+T細(xì)胞CD107a表達(dá)，結(jié)果顯示結(jié)腸癌細(xì)胞MC38與Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟單細(xì)胞懸液以1∶1、1：3、3∶1的效靶比培養(yǎng)72 h后，在效靶比1∶1時(shí)Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠CD8+T細(xì)胞表達(dá)CD107a明顯上調(diào)(圖12)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞的表型

3 討論

高甘油三酯血癥是最常見(jiàn)的脂質(zhì)紊亂表現(xiàn)。代謝和免疫之間復(fù)雜而密切的相互作用可以說(shuō)是機(jī)體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的核心機(jī)制[12]。高甘油三酯血癥及其富含甘油三酯脂蛋白殘余物的代謝后遺癥能致使動(dòng)脈粥樣硬化，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)和進(jìn)展增加。高甘油三酯血癥與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、癌癥等多種疾病有關(guān)，而且這些疾病的發(fā)生往往伴隨著體內(nèi)免疫功能的紊亂。

圖4 胞內(nèi)染色法檢測(cè)Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞分泌IFN-

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟NK細(xì)胞頻率

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟髓系抑制性細(xì)胞頻率

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞的頻率及活性

圖8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的頻率

我們運(yùn)用了Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠對(duì)比，體質(zhì)量變化無(wú)明顯區(qū)別，且轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出更高的血漿甘油三酯水平，血清顏色為乳白色。轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟中CD8+T細(xì)胞頻率增加，且活化的CD8+T細(xì)胞中CD3+CD8+CD44+，CD3+CD8+NKG2D+細(xì)胞的頻率顯著增加。T細(xì)胞活化后分化為效應(yīng)性和記憶性T細(xì)胞，因此用效應(yīng)性T細(xì)胞殺傷細(xì)胞凝集素樣受體1(KLRG1)[13]來(lái)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CD8+CD44+CD62L-，CD8+CD44+KLGR1+細(xì)胞的頻率均顯著增加，表明活化的CD8+T細(xì)胞中主要以效應(yīng)性T細(xì)胞為主。在CD8+T細(xì)胞與結(jié)腸癌細(xì)胞MC38共培養(yǎng)條件下，CD8+T細(xì)胞的生物殺傷活性明顯增強(qiáng)，同時(shí)，轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟中CD4+T細(xì)胞頻率及表型無(wú)顯著變化，NK細(xì)胞的頻率降低，MDSC細(xì)胞的頻率升高。這些結(jié)果表明，Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠在甘油三酯水平顯著升高的條件下脾臟免疫細(xì)胞的表型及活性發(fā)生明顯變化。對(duì)于免疫細(xì)胞群而言，淋巴細(xì)胞的功能主要受到局部微環(huán)境生長(zhǎng)因子(如細(xì)胞因子IL-2、IL-3、IL-4等)和細(xì)胞自身代謝變化的調(diào)控[14]。當(dāng)局部養(yǎng)料或能量供給發(fā)生變化(如腫瘤或炎癥微環(huán)境)時(shí)，對(duì)淋巴細(xì)胞的功能活性可產(chǎn)生重要影響[15]。在免疫細(xì)胞群中，T細(xì)胞在免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮中樞的作用，可分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞兩個(gè)不同的亞群。Wang等[16]發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞發(fā)揮免疫作用是不依賴CD4+T細(xì)胞的，在炎癥感染的后期階段CD8+T細(xì)胞激活并產(chǎn)生細(xì)胞因子，CD8+T細(xì)胞主要通過(guò)產(chǎn)生高度表達(dá)的穿孔素，對(duì)靶細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性作用(CTL)，裂解被感染的巨噬細(xì)胞，使其發(fā)生凋亡，是炎癥免疫應(yīng)答的一個(gè)關(guān)鍵的因素。這解釋了Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞中，主要是以CD8+T細(xì)胞發(fā)揮免疫應(yīng)答作用，而CD4+T細(xì)胞的頻率及活性無(wú)明顯變化。NKG2D是表達(dá)于NK、CD8+T、NKT、γδT以及部分巨噬細(xì)胞表面的活化性受體。當(dāng)NKG2D與其配體MHC I類相關(guān)分子(MHC class I chain-related protein，MICA或MICB)結(jié)合后，激活NK和CD8+T淋巴細(xì)胞，成為機(jī)體發(fā)揮抗免疫活性的關(guān)鍵分子[17-18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)活化的CD8+T細(xì)胞頻率增加，我們認(rèn)為較野生型小鼠而言，Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠誘發(fā)高甘油三酯血癥可能導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，從而使機(jī)體內(nèi)免疫功能紊亂，免疫細(xì)胞頻率及表型發(fā)生變化，活化的CD8+T細(xì)胞以效應(yīng)性T細(xì)胞發(fā)揮主要作用。同時(shí)，T淋巴細(xì)胞也是介導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞群，其中Treg、Th17、Th22細(xì)胞亞群是能夠促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的負(fù)性免疫調(diào)控細(xì)胞，我們檢測(cè)到CD8+T細(xì)胞的CD107也表達(dá)升高，說(shuō)明其抗腫瘤能力明顯提高。而NK細(xì)胞可快速分泌多種細(xì)胞因子參與免疫應(yīng)答及調(diào)控，研究表明[19]，代謝性炎癥這種微環(huán)境可改變NK細(xì)胞的表型，脂肪組織能使NK細(xì)胞活化并產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子，但本研究中著重檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟組織中的NK細(xì)胞頻率，其表現(xiàn)為下調(diào)，因此我們猜測(cè)在不同組織中，NK細(xì)胞的頻率變化不同，脾臟中NK細(xì)胞表達(dá)變化和脂肪組織中的不同之處及其發(fā)生機(jī)制將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)探討。另外，髓系抑制性細(xì)胞(MDSC)是樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞的前體，是一群具有很強(qiáng)免疫抑制功能的異質(zhì)性細(xì)胞，在疾病的進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸中起重要調(diào)節(jié)作用[20]。小鼠MDSC的表型為CD11b+Gr-1+，分兩個(gè)亞型：粒細(xì)胞樣的MDSC(CD11b+Ly6CLy6G+)和單核細(xì)胞樣的MDSCs(CD11b+Ly6C+Ly6G-)。一項(xiàng)研究顯示[21]，部分侵襲性癌癥通過(guò)單酰甘油脂肪酶(一種脂解中重要的酶)的增加而與增加的游離脂肪酸(nonestesterified fatty acid，F(xiàn)FA)之間產(chǎn)生密切關(guān)聯(lián)。另外，一些其他脂類(甘油二酯和神經(jīng)酰胺)可作為次信使參與細(xì)胞生長(zhǎng)、存活的信號(hào)傳導(dǎo)通路，如磷脂酰肌醇-3激酶?jìng)鲗?dǎo)通路。MDSC主要通過(guò)產(chǎn)生精氨酸酶1(arginase-1，Arg-1)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase， iNOS)和 活 性 氧 (reactive oxygen，ROS)發(fā)揮免疫抑制功能。本研究顯示免疫細(xì)胞群中MDSC細(xì)胞頻率顯著增加，這也與之相一致。

圖9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟NKT和γδ T細(xì)胞的頻率

圖10 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟B細(xì)胞的頻率

圖11 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟巨噬細(xì)胞的頻率

圖12 流式細(xì)胞術(shù)分析CD8+T細(xì)胞CD107a表達(dá)

綜上所述，本研究初步探討了Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠的脾臟免疫細(xì)胞表型及活性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞頻率及活性顯著增強(qiáng)，但NK細(xì)胞頻率及功能減弱，MDSC細(xì)胞頻率增強(qiáng)。已有研究報(bào)道，Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠導(dǎo)致的高甘油三酯血癥與痛風(fēng)、糖尿病、癌癥等有關(guān)，這為疾病診療發(fā)展與免疫功能的機(jī)制研究提供了一定的依據(jù)。雖然高甘油三酯血癥與多種疾病有關(guān)，但是這些變化的脾臟細(xì)胞與Apo C3轉(zhuǎn)基因小鼠在脂質(zhì)代謝、癌癥發(fā)病之間有著怎樣的關(guān)聯(lián)？這群變化的免疫細(xì)胞究竟發(fā)揮了怎樣的免疫調(diào)節(jié)功能，是否參與了脂質(zhì)代謝、癌癥發(fā)病的免疫作用，這些機(jī)制仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步討論。