尼可地爾對(duì)兔實(shí)驗(yàn)性空氣肺栓塞動(dòng)脈高壓的作用研究

王海鵬 屈百鳴 張健

肺 動(dòng) 脈 高 壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）由世界衛(wèi)生組織（WHO）劃分為原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓和繼發(fā)性肺動(dòng)脈高壓，其中繼發(fā)性肺動(dòng)脈高壓發(fā)病率較高，是由多種疾病逐漸發(fā)展出現(xiàn)肺血管阻力，右心負(fù)荷升高最終導(dǎo)致右心功能衰竭的一組臨床病理綜合征［1］。繼發(fā)性肺動(dòng)脈高壓相關(guān)的治療仍是目前醫(yī)學(xué)難點(diǎn)，現(xiàn)多項(xiàng)臨床研究已經(jīng)證實(shí)KATP通道參與了血管收縮和重構(gòu)的病理過(guò)程，對(duì)舒張肺血管效果明顯［2］。缺氧狀態(tài)時(shí)KATP通道開(kāi)放劑能夠顯著提高肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上鉀離子通道的活性，對(duì)舒張肺血管效果較為明顯［3］。本實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用的尼可地爾屬于煙酰胺類KATP通道開(kāi)放劑，化學(xué)名硝酸乙氧煙酰胺，其作用機(jī)制主要可歸納為使血管平滑肌松弛和血管舒張［4］、改善肺動(dòng)脈血管的重構(gòu)。作者自2013年1月至2014年12月通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究尼可地爾對(duì)肺動(dòng)脈高壓的療效，將肺動(dòng)脈壓力測(cè)定、超聲評(píng)估等方面作為研究重點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)新西蘭大白兔50只，體重1.6～2.0kg，雌雄不限，兔齡5～6個(gè)月，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。RM6240系列多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)（成都儀器廠），全功能心電監(jiān)護(hù)儀（spacelabs德國(guó)西門(mén)子公司），有創(chuàng)動(dòng)脈血壓壓力換能器（深圳市新世聯(lián)科技有限公司），動(dòng)靜脈留置針（24G*0.75IN，蘇州碧迪醫(yī)療器械公司），20%氨基甲酸乙酯注射液（烏拉坦）（西安醫(yī)科大學(xué)藥廠生產(chǎn)），尼可地爾片 5mg×100（日本 Tohoku Nipro Pharmaceutical Corporation），光學(xué)顯微鏡（浙江中醫(yī)藥大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室提供）。采用計(jì)算機(jī)隨機(jī)數(shù)發(fā)生器將動(dòng)物隨機(jī)分為3組，分別為普通對(duì)照組15只、肺動(dòng)脈高壓模型組20只和尼可地爾藥物組15只，稱重并記錄。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）兔實(shí)驗(yàn)性肺動(dòng)脈高壓模型的制作：實(shí)驗(yàn)兔分別固定于活動(dòng)式立式兔實(shí)驗(yàn)固定臺(tái)上，1ml注射器經(jīng)耳緣靜脈建立靜脈通道，實(shí)驗(yàn)每日同一時(shí)段重復(fù)注射，連續(xù)28d。①普通對(duì)照組：經(jīng)耳緣靜脈緩慢注射生理鹽水，劑量為0.3ml/（kg·10min），注射完畢后觀察15min，確認(rèn)生命體征平穩(wěn)后放回兔籠。②肺動(dòng)脈高壓模型組：經(jīng)耳緣靜脈緩慢注射空氣團(tuán)，劑量為0.3ml/（kg·10min），注射完畢后觀察15min，確認(rèn)生命體征平穩(wěn)后放回兔籠。③尼可地爾藥物干預(yù)組：操作同肺動(dòng)脈高壓組實(shí)驗(yàn)兔。此外，尼可地爾片溶解于生理鹽水后灌胃，劑量為1.15mg/kg，灌胃3次/d，重復(fù)28d，灌胃完畢后觀察15min/次，確認(rèn)生命體征平穩(wěn)后放回兔籠。（2）肺動(dòng)脈內(nèi)徑及Tei指數(shù)的超聲分析：實(shí)驗(yàn)方法：將實(shí)驗(yàn)兔水合氯醛（2.5ml/kg）灌腸鎮(zhèn)靜，左側(cè)仰臥位四肢固定于木板上，使木板向左傾斜30°，8%硫化鈉溶液均勻涂抹于胸前區(qū)，剃凈胸毛，使用GE公司Vivid 7 Dimension超聲心動(dòng)圖儀，M3S探頭，頻率1.5～3.5MHz。超聲探頭置于兔胸骨左側(cè)進(jìn)行測(cè)量，獲取心底短軸及心尖四腔切面，測(cè)定肺動(dòng)脈內(nèi)徑（如圖1）。啟用定量組織速度成像模式，取樣點(diǎn)置于右室游離壁三尖瓣環(huán)位置，以TDI的速度脈沖方式顯示三尖瓣環(huán)運(yùn)動(dòng)頻譜 ：收縮期s波、舒張?jiān)缙趀波，舒張晚期a波（如圖2），測(cè)量右室等容收縮時(shí)間（ICT）、等容舒張時(shí)間（IRT）及射血時(shí)間（ET），計(jì)算右室Tei指數(shù)（如圖3）。選擇清晰的圖像保存待以后分析，每只取3個(gè)心動(dòng)周期平均值［5］。Tei=（ICT+IRT）/ET；A：a波終末至下一心動(dòng)周期e波起始的間期=（A-B）/B；B：a波終末至下一心動(dòng)周期s波的終止間期（3）兔實(shí)驗(yàn)性肺動(dòng)脈高壓模型建立及尼可地爾干預(yù)組、正常對(duì)照組的肺動(dòng)脈壓力測(cè)量：①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備：兔固定于兔實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，經(jīng)耳緣靜脈予靜脈留置針建立靜脈通道，肝素封管。用20%烏拉坦溶液經(jīng)耳緣靜脈緩慢注射麻醉，麻醉劑量為5ml/kg。用8%硫化鈉溶液分別于近軀干右上肢、左上肢、右下肢及左下肢皮膚上（各部位面積約3cm×5cm）進(jìn)行脫毛，胸骨處（面積約5cm×5cm）進(jìn)行脫毛。切開(kāi)氣管并插入氣管導(dǎo)管以備接呼吸機(jī)用。準(zhǔn)備壓力換能器再連接到多通道生理儀，連接ECG，以監(jiān)測(cè)心率，心律。②肺動(dòng)脈壓力測(cè)定：實(shí)驗(yàn)兔胸骨柄左緣第二肋開(kāi)始切開(kāi)約2cm手術(shù)切口，依次為皮膚、皮下筋膜、肌肉、肋骨。以120mm小三爪自動(dòng)牽開(kāi)器緩慢擴(kuò)張胸骨切口。暴露切口，不打開(kāi)心包，彎鉗緩慢剝離甲狀腺，即可定位肺動(dòng)脈主干，動(dòng)脈穿刺針穿刺肺動(dòng)脈并置管，固定后接壓力換能器再連接到多通道生理儀，監(jiān)護(hù)儀上可見(jiàn)肺動(dòng)脈壓力波形（如圖3），穩(wěn)定1～2min后，分別記錄肺動(dòng)脈的收縮壓、舒張壓和平均壓。③實(shí)驗(yàn)觀察與記錄：多道電生理儀記錄實(shí)驗(yàn)兔肺動(dòng)脈壓力，應(yīng)用RM6240系列多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)軟件處理并分析實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺動(dòng)脈壓力，以區(qū)域測(cè)量方法測(cè)得肺動(dòng)脈壓力舒張壓、收縮壓、脈壓差、平均壓。

圖1 超聲心動(dòng)圖測(cè)量肺動(dòng)脈內(nèi)徑

圖2 多普勒超聲心動(dòng)圖測(cè)量

圖3 肺動(dòng)脈壓力波形圖

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，三組間Tei值比較采用單因素方差分析，肺動(dòng)脈內(nèi)徑比較采用t檢驗(yàn)，肺動(dòng)脈壓力比較進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立樣本Mann-Whitney檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià) 超聲測(cè)量的各組肺動(dòng)脈內(nèi)徑值比較見(jiàn)表1。各組ICT、IRT、ET及Tei指數(shù)比較見(jiàn)表2。

表1 各組肺動(dòng)脈內(nèi)徑值比較（x±s）

表2 各組ICT、IRT、ET及Tei指數(shù)比較（x±s）

2.2 三組肺動(dòng)脈壓力測(cè)定比較 見(jiàn)表3。

表3 三組肺動(dòng)脈壓力測(cè)定比較［mmHg，（x±s）］

3 討論

目前肺動(dòng)脈高壓的制作模型多應(yīng)用低氧環(huán)境下飼養(yǎng)［6］、野百合堿藥物注射［7］、高血流量外科手術(shù)［5］等方法制作，其中應(yīng)用最為廣泛的是缺氧艙下制作的低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型。本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性的選擇使用“空氣肺栓塞”的方法建立肺動(dòng)脈高壓的兔實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。最后測(cè)得13只實(shí)驗(yàn)兔的平均壓力為（38.763±7.000）mmHg，相對(duì)于正常對(duì)照組實(shí)驗(yàn)兔測(cè)得肺動(dòng)脈平均壓（22.413±0.913）mmHg明顯升高約16mmHg，符合肺動(dòng)脈高壓的肺動(dòng)脈壓力診斷標(biāo)準(zhǔn)，且通過(guò)超聲評(píng)價(jià)所得出的結(jié)果一致性較強(qiáng)，可得知本實(shí)驗(yàn)中這種新型的“空氣栓塞”法建立肺動(dòng)脈高壓模型的方法是成功且為可復(fù)制的，為肺動(dòng)脈高壓治療的研究提供了一種新型的動(dòng)物模型建立方法?！翱諝馑ㄈ钡姆椒ń⒎蝿?dòng)脈高壓的動(dòng)物模型具體生理機(jī)制為：空氣在血管中形成小的氣泡通過(guò)右心房進(jìn)入右心室，在右心室被擊碎成極小的氣泡進(jìn)入肺動(dòng)脈，在細(xì)小的肺動(dòng)脈中形成栓塞，從而造成了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的缺氧狀況，持續(xù)一段時(shí)間后融入血液，缺氧情況逐漸緩解。而連續(xù)28d的重復(fù)性操作，則會(huì)引起肺血管的收縮和重構(gòu)。

新型的“空氣栓塞”肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型較傳統(tǒng)的肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型的優(yōu)點(diǎn)主要包括：（1）簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)：此模型制作方法簡(jiǎn)單，僅需在耳緣靜脈建立靜脈通道后用空氣團(tuán)注射即可；且所使用的實(shí)驗(yàn)設(shè)備較少，僅需實(shí)驗(yàn)兔固定臺(tái)、一次性注射器和留置針。（2）可復(fù)制性強(qiáng)：本實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)條件要求較低，且無(wú)需建立專門(mén)的低氧艙，可以大批量的復(fù)制動(dòng)物模型。（3）使用動(dòng)物更廣泛：本實(shí)驗(yàn)可在兔上成功建立模型，為肺動(dòng)脈高壓的動(dòng)物模型家族增添新的成員。（4）更接近臨床：注射野百合堿作為最為經(jīng)典的肺動(dòng)脈高壓模型建立方法被廣泛應(yīng)用，但其主要是野百合堿通過(guò)炎癥反應(yīng)損傷肺動(dòng)脈內(nèi)皮，誘導(dǎo)肺動(dòng)脈血管重建來(lái)建立的接近結(jié)締組織相關(guān)肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物模型。與臨床上常見(jiàn)的低氧性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制有一定的差異［8］。

當(dāng)然，任何新的事物的出現(xiàn)都是一個(gè)從基本逐漸走向完美的過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)中創(chuàng)新性的建立空氣栓塞肺動(dòng)脈高壓實(shí)驗(yàn)兔模型優(yōu)點(diǎn)突出，而在具體的操作過(guò)程中遇到的困難也不可忽略。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中主要的困難包括：（1）操作要求嚴(yán)格：因?yàn)槊總€(gè)動(dòng)物的體質(zhì)差異，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，空氣團(tuán)注射是較為困難的操作，既要求注射速度適中，也需在動(dòng)物出現(xiàn)不能耐受的情況下及時(shí)停止操作，避免動(dòng)物的死亡。（2）感染情況：兔肺部嬌嫩，極易出現(xiàn)肺部感染，而空氣的注入則會(huì)加大肺部的感染率，且在模型建立后期，因肺動(dòng)脈高壓導(dǎo)致的右心功能減退，也會(huì)出現(xiàn)肺瘀血等癥狀，從而出現(xiàn)肺部感染。在實(shí)際操作過(guò)程中，有近1/10的實(shí)驗(yàn)兔因肺部感染嚴(yán)重而不能作為模型參與實(shí)驗(yàn)。（3）病死率：空氣注射對(duì)注射方法、時(shí)間及速度要求嚴(yán)格，否則會(huì)出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡，在具體的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中確實(shí)出現(xiàn)猝死現(xiàn)象。

目前超聲心動(dòng)圖作為一項(xiàng)無(wú)創(chuàng)檢查技術(shù)為肺動(dòng)脈高壓的診斷提供了非常重要的依據(jù)，與右心導(dǎo)管檢查有較好的相關(guān)性，其診斷價(jià)值已得到廣泛認(rèn)可。超聲心動(dòng)圖既可以對(duì)肺動(dòng)脈高壓原發(fā)病能做出診斷，也能估測(cè)右心房壓力、肺動(dòng)脈的收縮壓和舒張壓。

在肺動(dòng)脈壓力測(cè)定的操作過(guò)程中主要出現(xiàn)的問(wèn)題有：隨著心臟的搏動(dòng)，肺動(dòng)脈導(dǎo)管測(cè)得的壓力曲線也會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的波動(dòng)，這對(duì)肺動(dòng)脈壓力測(cè)定后的統(tǒng)計(jì)造成了一定的難度。在插入動(dòng)脈留置針時(shí)需使用彎鑷輕夾肺動(dòng)脈壁，是否會(huì)造成肺動(dòng)脈交感興奮收縮從而導(dǎo)致壓力增高及開(kāi)胸對(duì)肺動(dòng)脈壓的影響仍有待進(jìn)一步的論證。

本次試驗(yàn)的對(duì)象是新西蘭大白兔，在物種上、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量，以及實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ屯R床實(shí)際疾病的發(fā)生還是存在一定差異，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了尼可地爾在抗兔肺動(dòng)脈高壓方面發(fā)揮了積極作用，為進(jìn)一步的研究打下基礎(chǔ)。