羊蹄甲和穿山甲炮制品比較鑒別

沈多榮, 王慧芳, 吳芝園, 沈 敏, 談如藍(lán), 劉 遜*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215009；2.蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 蘇州 215009)

穿山甲，又名山甲片、甲片，為鯪鯉科動(dòng)物穿山甲(Manis pentadactyla)的鱗甲，為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，具有通經(jīng)下乳，消腫排膿，搜風(fēng)通絡(luò)等功效。穿山甲鱗片由特殊的高酪氨酸β-角蛋白(KAP)構(gòu)成，含有膽固醇、二十三酸丁胺、脂肪族酰胺以及蛋白、D-絲-L-酪環(huán)二肽、L-絲-L-酪環(huán)二肽等主要成分。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)穿山甲經(jīng)砂炒炮制后，脂溶性成分無顯著變化、而蛋白成分顯著減少，環(huán)二肽顯著增加[1]。而且穿山甲炮制品的標(biāo)志性成分D-絲-L-酪氨酸環(huán)二肽、L-絲-L-酪氨酸環(huán)二肽、L-甘-L-酪氨酸環(huán)二肽的含量變化與炮制條件存在相關(guān)性[2-3]。

羊蹄甲，為羊的蹄甲殼，民間有羊蹄甲代穿山甲的用藥習(xí)慣[4]，市場(chǎng)上也有使用羊蹄甲炮制品冒充穿山甲的現(xiàn)象。目前有關(guān)于中藥材鑒別的常見方法有通過性狀，氨基酸組成分析，凝膠電泳分析、薄層層析等[5-7]。但羊蹄甲的鑒定研究過去主要集中于原藥材，對(duì)于羊蹄甲炮制品的鑒別則未見報(bào)道，為了探討羊蹄甲與穿山甲炮制品在形態(tài)與成分方面的異同，本研究擬通過性狀、TLC、HPLC鑒定研究羊蹄甲與穿山甲炮制品在性狀與成分的異同，建立鑒定羊蹄甲與穿山甲炮制品的方法，以去偽存真。

1 材料與方法

1.1 供試材料

D-絲-L-酪氨酸環(huán)二肽、L-絲-L-酪氨酸環(huán)二肽、L-甘-L-酪氨酸環(huán)二肽對(duì)照品為課題組自制，通過1H-NMR、13C-NMR等方法確證其結(jié)構(gòu)，HPLC法檢測(cè)純度>99%；甲醇，磷酸，三乙胺(色譜純，F(xiàn)isher公司)。

TLC Scanner4 System薄層系統(tǒng)(瑞士CAMAG公司)；DGLC-3600 UltiMate? 3000高效液相色譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；本實(shí)驗(yàn)所用材料來源于蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院館藏標(biāo)本。樣品均由作者通過性狀結(jié)合Cytb序列鑒定[8]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品加工 羊蹄甲和穿山甲的炮制品為藥材經(jīng)砂燙加工而成，具體操作方法：分別取羊蹄甲和穿山甲，按照2015版藥典附錄Ⅱ D的燙法進(jìn)行炮制，用砂燙至羊蹄甲和穿山甲全體膨脹呈卷曲狀，呈黃色，質(zhì)酥脆，臨用前搗碎成粉末。

1.2.2 性狀鑒定方法 從整體及粉末的大小、形態(tài)、色澤等方面[9]，對(duì)羊蹄甲及穿山甲炮制品進(jìn)行性狀鑒定。

1.2.3 TLC鑒別方法 取羊蹄甲炮制品和穿山甲炮制品，粉碎成粗粉(過60目)。按藥典穿山甲鑒別項(xiàng)下規(guī)定分別取羊蹄甲和穿山甲炮制品粗粉1 g置于不同燒瓶中，各加50 mL的二氯甲烷，加熱回流提取1 h，放冷后過濾，取濾液進(jìn)行蒸干，殘?jiān)? mL二氯甲烷復(fù)溶，即得供試品溶液。用毛細(xì)管分別吸取羊蹄甲炮制品溶液和穿山甲炮制品溶液10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上。分別采用3種展開系統(tǒng)進(jìn)行展開，取出后晾干，噴適量的10%硫酸乙醇溶液顯色，在105 ℃加熱數(shù)分鐘，置紫外光燈(365 nm)下檢視。

1.2.4 HPLC檢測(cè)方法

1.2.4.1 色譜條件 色譜柱Hypersil ODS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫：30 ℃，流速：0.5 mL/min，流動(dòng)相：甲醇-0.5%磷酸(15∶85)，檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm，進(jìn)樣量10 μL[10-11]。

1.2.4.2 供試品溶液 精密稱取羊蹄甲炮制品和穿山甲炮制品的粉末(過6號(hào)篩)各1 g，分別置于不同的錐形瓶中，加15 mL水稱重后，超聲提取30 min。放冷至室溫，稱重后用水溶液補(bǔ)足減失的量并搖勻，進(jìn)行過濾處理。取續(xù)濾液，用0.22 μm水系微孔濾膜濾過，即得到供試品溶液。在上述色譜條件下檢測(cè)分析，得到羊蹄甲炮制品和穿山甲炮制品的HPLC色譜圖。

精密稱取對(duì)照品D-絲-L-酪氨酸環(huán)二肽、L-絲-L-酪氨酸環(huán)二肽、L-甘-L-酪氨酸環(huán)二肽適量，用流動(dòng)相溶解，配制得到質(zhì)量濃度分別為 0.1 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。在上述色譜條件下檢測(cè)分析，得到對(duì)照品色譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 性狀鑒定

羊蹄甲炮制品全體膨脹成鞋頭狀，外表面呈淡黃色至黃棕色，蹄壁厚薄不一，內(nèi)中空呈船狀，蹄底部有的呈三角形，質(zhì)酥脆，易碎(圖1)。穿山甲炮制品全體膨脹成扁片狀或卷曲成不規(guī)則狀，外表面呈淡黃色至黃棕色，寬端有數(shù)十條排列整齊的縱紋及數(shù)條橫線紋，內(nèi)表面中部有一條明顯突起的弓形橫向棱線(圖1)。表明炮制品在外觀性狀方面存在顯著差異，但兩者粉末按藥典穿山甲鑒別項(xiàng)下進(jìn)行鑒別則無顯著區(qū)別。

圖1 羊蹄甲炮制品和穿山甲炮制的外觀性狀圖

2.2 TLC鑒別

羊蹄甲炮制品與穿山甲炮制品在TLC色譜相同的位置上，主要斑點(diǎn)分別顯相同顏色熒光斑點(diǎn)，表明兩者在TLC方面無法區(qū)別(圖2)。

圖2 TLC色譜圖

2.3 HPLC檢測(cè)

HPLC結(jié)果表明：羊蹄甲炮制品溶液中沒有檢測(cè)到穿山甲標(biāo)志性成分D-絲-L-酪氨酸環(huán)二肽、L-絲-L-酪氨酸環(huán)二肽、L-甘-L-酪氨酸環(huán)二肽，而穿山甲炮制品具有這三種的標(biāo)志性成分。表明HPLC可以區(qū)分羊蹄甲與穿山甲炮制品(圖3)。

圖3 HPLC色圖譜

3 結(jié)論與討論

穿山甲由于環(huán)境破壞及人為盜獵，其資源日漸瀕危，價(jià)格也越來越高昂，不法分子為了謀求暴利，市場(chǎng)上存在著大量的以假亂真、摻假混淆等現(xiàn)象如用羊蹄甲炮制品冒用穿山甲，穿山甲、羊蹄甲炮制品兩者整體性狀存在差異，但是穿山甲臨床調(diào)劑時(shí)需打碎入藥，對(duì)于粉末狀的穿山甲、羊蹄甲炮制品，藥典穿山甲鑒別項(xiàng)下的粉末觀察方法由于穿山甲粉末缺乏特征鑒別點(diǎn)，兩者難以進(jìn)行真?zhèn)巫R(shí)別。

為了區(qū)分兩者的粉末，本研究用苯-丙酮(20∶1)、三氯甲烷-乙酸乙酯(19∶1)、正己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(7∶2∶0.5)3種TLC展開系統(tǒng)對(duì)穿山甲和羊蹄甲進(jìn)行鑒別。由于羊蹄甲、穿山甲均來源于哺乳動(dòng)物的角蛋白，兩者脂溶性成分相近，導(dǎo)致薄層色譜中的主要斑點(diǎn)顏色及Rf值相近，說明藥典項(xiàng)下的穿山甲薄層鑒別方法缺乏專屬性，無法對(duì)羊蹄甲類藥材做出鑒別。

而穿山甲與羊蹄甲炮制品水提液的HPLC圖譜有顯著差異，本法分辨力強(qiáng)，重現(xiàn)性好，可以快速、有效地鑒定穿山甲與羊蹄甲炮制品的藥材與粉末，這可能是由于穿山甲中酪氨酸含量較高，炮制后產(chǎn)生的小肽以酪氨酸環(huán)二肽同系物為主；這保證了穿山甲炮制品的質(zhì)量，可為也保障人民群眾用藥安全提供有效依據(jù)。