肉蓯蓉多糖閃式提取工藝及其抗糖基化分析

張喜峰，鄧猛猛，羅光宏，楊生輝，王丹霞

(1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖 734000；2.甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅 張掖 734000；3.河西學(xué)院甘肅省微藻工程技術(shù)研究中心，甘肅 張掖 734000)

非酶糖基化是指蛋白質(zhì)或氨基酸中游離氨基與還原糖的醛基之間發(fā)生一系列重排、脫水、氧化、縮合等反應(yīng) (又稱 Maillard反應(yīng))，從而形成具有活性的晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)[1]，其與機體氧化應(yīng)激有關(guān)，可引發(fā)糖尿病、腎臟疾病、阿爾茨海默病(AD)等慢性疾病[2-3].

肉蓯蓉(Cistanchedeserticola)為列當(dāng)科肉蓯蓉屬多年生植物，寄生在梭梭類植物根部，在中國主要產(chǎn)于新疆、內(nèi)蒙古、甘肅和寧夏等地，素有“沙漠人參”之美譽[4].肉蓯蓉長期以來被用作治療腎虛陽痿、老年便秘、腰膝酸痛、血虛癥等[5].藥理研究表明，肉蓯蓉具有抗炎活性[6-7]、抗骨質(zhì)疏松[8]、鎮(zhèn)靜[9]、抗疲勞等活性[10-11].多糖為肉蓯蓉主要有效成分之一，具有降血糖、降血脂作用[12]和對淋巴細胞的免疫活性[13]等功效.

閃式提取法作為一種新型提取方法，是利用一定量溶劑在閃式容器中將物料高速攪拌，從而達到物料組織細胞壁快速破碎，有效成分釋放進入提取液，該方法可在短時間內(nèi)完成，具有顯著減低能耗，節(jié)約成本的作用[14-15].衛(wèi)強等[16]比較了4種提取多糖方法，閃式提取具有較佳的提取效果；李明華等[17]優(yōu)化了金針菇多糖閃式提取工藝，與高溫浸提相比，其提取率提高了40.08%；程振玉等[18]研究表明，閃式法對北五味子多糖提取率高于回流法和微波輔助法，且耗費時間短，溶劑用量少.但目前為止，有關(guān)肉蓯蓉多糖的提取主要采用表面活性劑輔助提取法[19]、熱水浸提法[20]、循環(huán)超聲提取法[21]等傳統(tǒng)方法，采用閃式提取的相關(guān)研究還未見報道.

因此，基于肉蓯蓉多糖優(yōu)越的功能特性，本研究以肉蓯蓉為材料，采用響應(yīng)面試驗優(yōu)化閃式提取肉蓯蓉多糖的條件，初步探討其多糖對糖基化產(chǎn)物的抑制效果，以期能為肉蓯蓉多糖資源的開發(fā)和利用提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

肉蓯蓉：購于張掖市甘州區(qū)德生堂藥店，經(jīng)羅光宏教授鑒定為列當(dāng)科肉蓯蓉屬多年生植物，干燥粉碎后密封保存；無水乙醇、苯酚、濃硫酸、葡萄糖、賴氨酸均為分析純.

DD-5M低速大容量離心機，湖南凱達科學(xué)儀器有限公司；722S可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司制造；梅特勒電子天平ME54E，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；LS55型熒光光度計，PE公司； JHBE-50T(實驗型)閃式提取器，河南智晶生物科技股份有限公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 肉蓯蓉多糖提取液的制備 準(zhǔn)確稱取一定量粉碎后肉蓯蓉粉末，按照一定料液比加入蒸餾水，轉(zhuǎn)移至閃式提取器中，在一定提取轉(zhuǎn)速下提取一定時間后，4 000 r/min離心10 min，將上清液定容至100 mL，混勻后，待用.

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及肉蓯蓉中多糖含量的計算 參照文獻[11]的方法，略作修改.準(zhǔn)確吸取濃度為100 μg/mL的葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于具塞試管中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%苯酚1 mL，再加入5 mL濃硫酸，加水補足至8 mL，混勻，在490 nm處測定吸光度，以濃度C為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)進行線性回歸分析.得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程C=12.402x-0.009 1，R2=0.997 6.

精密吸取1.2.1制備的多糖提液0.2 mL置于具塞試管中，依次加入6%苯酚1 mL和濃硫酸5 mL，加水補足至8 mL，充分搖勻后，放置冷卻至室溫，以不加提取液的混合試劑為空白對照，在490 nm處測定吸光值，計算多糖得率.

(1)

式中，C為提取液中多糖質(zhì)量濃度(mg/mL)；V為提取液的體積(mL)；M為肉蓯蓉樣品質(zhì)量(g).

1.2.3 閃式提取肉蓯蓉多糖單因素試驗設(shè)計 參照文獻[22]的方法，略作改動.在提取轉(zhuǎn)速為6 000 r/min，提取時間為60 s，料液比為1∶50 g/mL的條件下，固定其他條件不變，設(shè)置料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL；提取時間40、50、60、70、80 s，提取轉(zhuǎn)速2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 r/min，以多糖提取得率為指標(biāo)，進行單因素試驗，每個試驗重復(fù)3次.

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上，對料液比(A)、提取轉(zhuǎn)速(B)、提取時間(C)為自變量，多糖得率為因變量，利用Design-expert 8.0.6.0軟件進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計，見表1.

1.2.5 肉蓯蓉多糖抗糖基化活性的測定 參照文獻[23]的方法，采用賴氨酸/葡萄糖模擬體系評價非酶反應(yīng)過程中AGEs形成情況，取濃度為0.2 mol/L的賴氨酸溶液和葡萄糖溶液各1mL，加入1 mL多糖溶液(0.1～0.5 mg/mL)充分混勻，在溫度為37 ℃密封孵育10 d，在λex/λem=370 nm/440 nm測定不同濃度下的熒光值，采用同濃度的氨基胍(AG)作為陽性對照.以不添加多糖但水浴10 d的模擬體系為對照組；以不添加多糖也不水浴的賴氨酸/葡萄糖模擬體系為空白組.按以下公式計算肉蓯蓉多糖對賴氨酸/葡萄糖模擬體系A(chǔ)GEs相對抑制率.

表1 試驗因素及水平

式中，F(xiàn)樣品為加入多糖提取液且水浴的反應(yīng)液的熒光值；F對照為不添加多糖但水浴的賴氨酸/葡萄糖模擬體系的熒光值；F空白為不添加多糖也不水浴的賴氨酸/葡萄糖模擬體系的熒光值.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比的影響 由圖1可知，當(dāng)料液比在1∶20～1∶50范圍內(nèi)時，多糖得率呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢；當(dāng)料液比為1∶50時，多糖得率達到最大值.原因可能是隨著提取液體積逐漸增加，提取液中溶出多糖的濃度逐漸減小，形成了一定的濃度梯度[24].因此，多糖擴散速率快，得率高；當(dāng)料液比超過1∶50后，多糖得率增加不顯著，提取液體積增加導(dǎo)致熱能消耗過多，且增加后序濃縮處理時的步驟.因此.確定料液比為1∶50.

2.1.2 提取轉(zhuǎn)速的影響 由圖2可知，隨著提取轉(zhuǎn)速逐漸增加，多糖得率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，當(dāng)提取轉(zhuǎn)速為6 000 r/min時，提取得率達到最大值.原因可能是隨著閃式提取器中內(nèi)刀轉(zhuǎn)速提高，在內(nèi)外刀之間產(chǎn)生巨大剪切力，外刀腔內(nèi)產(chǎn)生負(fù)壓.在此環(huán)境中，物料組織破碎，暴露出有效成分，且在高速碰撞作用下被提取溶劑包圍、解離、溶解，達到濃度平衡的過程.當(dāng)提取轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大時，引起刀頭產(chǎn)熱過多，影響提取得率.因此，提取轉(zhuǎn)速確定為6 000 r/min.

圖1 料液比對肉蓯蓉多糖提取得率的影響Figure 1 Effect of solid to liquid ratio on the yield of CDPs

圖2 提取轉(zhuǎn)速對肉蓯蓉多糖提取得率的影響Figure2 Effect of extraction speed on the yield of CDPs

2.1.3 提取時間的影響 由圖3可知，在提取時間為40～60 s范圍內(nèi)，多糖得率呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢；當(dāng)提取時間為60 s時，多糖得率達到最大值；繼續(xù)增加提取時間，多糖得率逐漸下降.這主要是由于提取時間較少時，多糖未全部溶解于提取液中，隨著時間延長，物料受到閃式提取器內(nèi)外刀剪切、碰撞作用，促進多糖得率提高；當(dāng)提取時間達到一定值后，由于劇烈碰撞導(dǎo)致溫度升高，可能使多糖結(jié)構(gòu)遭受一定程度破壞.因此，提取時間選擇以60 s為宜.

2.2 響應(yīng)面試驗優(yōu)化結(jié)果及分析

2.2.1 模型擬合及數(shù)據(jù)分析 在單因素基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計對影響多糖得率的因素進行試驗設(shè)計，結(jié)果見表2.

圖3 提取時間對閃式提取肉蓯蓉多糖的影響Figure 3 Effect of extraction time on the flash extraction of CDPs

響應(yīng)面試驗設(shè)計及方差分析見表2～3.三因素優(yōu)化后二次回歸方程為：多糖得率(%)=12.11+0.28A-0.77B+0.071C-1.02AB-0.025AC+0.52 BC-0.95A2-1.81B2-1.27C2

表2 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計及其結(jié)果

表3 響應(yīng)面二次模型方差分析結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面3D圖分析 圖4反映了提取參數(shù)二者間相互作用對肉蓯蓉多糖得率的影響.如圖4A所示，當(dāng)提取時間(C)固定在零水平時，料液比(A)和提取轉(zhuǎn)速(B)二者對肉蓯蓉多糖得率具有二次效應(yīng)；表明料液比和提取電壓之間交互作用差異極顯著，且與表3中的結(jié)果一致.當(dāng)料液比和提取轉(zhuǎn)速分別在1∶40～1∶50 (g/mL)和4 000～6 000 r/min范圍內(nèi)時，肉蓯蓉多糖得率呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢.圖4B、4C反映結(jié)果與圖4A是類似的.

圖4 肉蓯蓉多糖得率的響應(yīng)面3D圖Figure 4 The effect of solid-liquid ratio(A),rotating speed(B),and extraction time(C) on the yield of polysaccharides ofCistanche deserticolaby 3D-response surface plots

2.2.3 最適條件的確定與驗證 由軟件分析可知，閃式提取肉蓯蓉多糖最適條件為：料液比為1∶53.16 (g/mL)、提取轉(zhuǎn)速為5 387.05 r/min、提取時間為59.63 s，多糖提取得率理論預(yù)測值為12.27%；在試驗驗證過程中，為了便于實際操作，最佳條件修正為：料液比為1∶53 (g/mL)、提取轉(zhuǎn)速為5 387 r/min、提取時間為60 s，在此條件下重復(fù)3次試驗，多糖提取平均得率為12.35%，與預(yù)測值較接近.說明此模型獲得的優(yōu)化條件可用于肉蓯蓉多糖提取.

2.3 肉蓯蓉多糖抗糖基化分析

由圖5可知，隨著多糖樣品質(zhì)量濃度逐漸增加，其對賴氨酸/葡萄糖模擬體系中AGEs抑制作用逐漸增加，在此范圍內(nèi)，體現(xiàn)二者間線性關(guān)系，且線性方程為：y=71.36x+18.744(R2=0.956 7)，其IC50為0.438 mg/mL；陽性對照氨基胍(AG)在此范圍內(nèi)線性方程為：y=93.04x+18.264(R2= 0.988 1)，其IC50為0.341 mg/mL.說明AG對糖基化抑制效果強于肉蓯蓉多糖，可能是由于制備的多糖含有其他成分，有待于對其進一步分離純化.

圖5 肉蓯蓉多糖和氨基胍(AG)抗糖基化作用Figure 5 Glycosylation effect of CDPS and aminoguanidine

3 討論

本文采用閃式提取法制備肉蓯蓉多糖，研究了料液比、提取轉(zhuǎn)速、提取時間對其得率的影響，結(jié)果表明，在最佳提取條件下，多糖得率為12.35%；合適的料液比利于閃式提取器攪拌方便，過濃的比例會影響破碎效果；過長提取時間促使不穩(wěn)定化學(xué)成分如蛋白質(zhì)、果膠等雜質(zhì)發(fā)生不可逆變性凝固，同時可能與部分有效成分結(jié)合形成沉淀，影響提取得率.肖道安[19]采用表面活性劑輔助提取肉蓯蓉多糖，最優(yōu)工藝條件下多糖得率為8.17%；熱水浸提[20]和超聲輔助[21]提取肉蓯蓉多糖，其得率分別為6.72%和7.58%.閃式提取得率大約是表面活性劑輔助提取的1.5倍，熱水浸提和超聲輔助的1.83倍和1.63倍，提取時間明顯縮短.因此，閃式提取肉蓯蓉多糖比傳統(tǒng)熱水浸提、超聲輔助和表面活性劑輔助提取得率要高.其機理可能為：依據(jù)內(nèi)外刀產(chǎn)生的剪切作用和負(fù)壓，使目標(biāo)成分多糖在外力作用下被溶劑包圍、解離、溶解，脫離后進入提取溶劑中，達到溶劑濃度平衡；閃式提取可能具有部分超聲波振動作用，對目標(biāo)成分在破碎物料內(nèi)外的溶解平衡產(chǎn)生強力推動作用.

4 結(jié)論

本文采用響應(yīng)面優(yōu)化試驗建立了閃式提取肉蓯蓉多糖工藝的二次多項式數(shù)學(xué)模型，方差分析可知，其模型差異極顯著，獲得方程擬合程度好，對其得率影響的各個因素主次順序為提取轉(zhuǎn)速>料液比>提取時間，最優(yōu)條件為料液比1∶53 (g/mL)、提取轉(zhuǎn)速為5 387 r/min、提取時間60 s，在此條件下，多糖提取平均得率為12.35%.本研究制備的肉蓯蓉多糖在一定濃度范圍內(nèi)對賴氨酸/葡萄糖模擬體系中AGEs具有一定的抑制效果，可為天然來源的AGEs抑制劑研究和開發(fā)提供參考依據(jù).