根腐病對黃芪根圍土壤酶活性影響的動(dòng)態(tài)分析

閆 歡，高 芬，王夢亮，秦雪梅

（1.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006；2.山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030006；3.山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，山西 太原 030006）

黃芪為豆科植物蒙古黃芪（Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.Mongholicus（Bge.）Hsiao）或膜莢黃芪（Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.）的干燥根[1]，具有提高免疫力、保護(hù)肝臟、滋養(yǎng)補(bǔ)益、利尿消腫、抗糖尿病等多種藥理功效。除了極高的藥用價(jià)值外，黃芪還可作為各種營養(yǎng)保健品開發(fā)的原料，用于草藥茶、軟飲料等的開發(fā)[2]。然而，近年來，隨著黃芪種植面積的不斷擴(kuò)大，根腐病在全國各大主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生。山西作為蒙古黃芪重要的道地產(chǎn)區(qū)，仿野生黃芪發(fā)病較輕，但人工栽植黃芪發(fā)病逐漸加重[3]，給黃芪產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成了很大影響。

作為一類毀滅性的土傳病害，黃芪根腐病的致病機(jī)制十分復(fù)雜。目前，山西大學(xué)中藥材病害研究課題組已經(jīng)從病原學(xué)的角度明確了其復(fù)合侵染的致病菌群，其中，最為重要的2 類優(yōu)勢病原真菌是銳頂鐮刀菌（Fusarium acuminatum）和腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）[4]。但是，近年來的研究也發(fā)現(xiàn)，包括各類土壤酶在內(nèi)的土壤微生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)失調(diào)與土傳病害發(fā)生有很大關(guān)聯(lián)。這些酶直接或間接參與并促進(jìn)土壤中一系列復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，包括碳、氮、磷、硫等元素的循環(huán)與遷移，其活性的高低不僅可反映土壤中生化反應(yīng)的強(qiáng)度和方向，而且可以表征土壤中物質(zhì)、能量代謝旺盛程度和土壤質(zhì)量水平[5-6]。因此，酶活性的紊亂會(huì)導(dǎo)致植物根際和根系的微生態(tài)環(huán)境發(fā)生改變，進(jìn)而利于土傳病害的滋生。游春梅等[7]研究表明，三七根腐病病株土壤中蔗糖酶、脫氫酶、磷酸酶、脲酶的活性均低于健康植株土壤，而多酚氧化酶活性則高于正常植株土壤。何川等[8]對煙田土壤酶活性與土傳病害的關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，煙草青枯病和黑脛病的病情指數(shù)與土壤淀粉酶、蔗糖酶、纖維素酶活性呈負(fù)相關(guān)。姜飛等[9]研究表明，辣椒患根腐病后，根際土壤中脫氫酶和過氧化氫酶活性降低，而具有抗性的嫁接辣椒根際土壤中脫氫酶、過氧化氫酶、過氧化物酶和多酚氧化酶的活性多顯著高于自根辣椒。綜上可見，土壤酶活性變化與土傳病害發(fā)生密切相關(guān)，但目前，針對黃芪根腐病的相關(guān)研究還未見報(bào)道。

本研究采集1～6年生黃芪根圍發(fā)病和健康土壤樣品，通過經(jīng)典方法測定并分析根腐病發(fā)生對4 種主要土壤酶（脲酶、纖維素酶、蔗糖酶和過氧化氫酶）活性的影響，旨在從微生態(tài)角度全面闡釋發(fā)病機(jī)理，為尋找更加有效且符合可持續(xù)發(fā)展理念的病害防治措施提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

樣品采自山西省大同市渾源縣仿野生黃芪種植基地，地處東經(jīng) 113.72°～113.76°，北緯 39.41°～39.48°，海拔1 708.80～1 989.40 m。根據(jù)當(dāng)?shù)匕l(fā)病情況，定向選擇1～6年生的黃芪健康地塊和發(fā)病地塊，5 點(diǎn)取樣法采集根圍土壤樣本，同時(shí)調(diào)查采樣地塊的發(fā)病情況。每點(diǎn)采集3～5 株黃芪根圍半徑10 cm、深度10 cm 之內(nèi)的土壤500 g，去除草根、石礫等雜物后，裝入無菌自封袋即為試驗(yàn)子樣品。帶回實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行風(fēng)干過篩處理，取子樣品各100 g混合均勻得最終試驗(yàn)樣品，4 ℃保存，盡快完成實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)所取土樣均為砂質(zhì)土。

1.2 黃芪根圍土壤酶活性測定

土壤酶活性測定參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。

脲酶采用苯酚鈉- 次氯酸鈉比色法測定，以24 h 后1 g 土壤中NH3-N 的毫克數(shù)表示酶活性；蔗糖酶和纖維素酶采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定，蔗糖酶的活性以24 h 后1 g 土壤生成葡萄糖的毫克數(shù)表示，纖維素酶活性以72 h 后10 g 土壤生成的葡萄糖的毫克數(shù)表示；過氧化氫酶采用KMnO4滴定法測定，其活性以1 g 土所消耗的0.02 mol/L KMnO4的毫升數(shù)表示。試驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病情調(diào)查

對采樣地塊仿野生黃芪的根腐病發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，1，2年生黃芪發(fā)病率最低，第3年發(fā)病率明顯升高，第4，5年逐漸加重，第6年又開始降低，且此時(shí)若不發(fā)病，以后則基本不會(huì)發(fā)病。1～6年生黃芪采樣地塊的發(fā)病率分別為3.33%，10.00%，26.67%，36.67%，43.33%，33.33%。

2.2 黃芪根圍發(fā)病和健康土壤中脲酶活性差異分析

脲酶活性常用來表征土壤中氮素的代謝情況，其酶促產(chǎn)物氨是植物的氮源之一。由測定結(jié)果可知，1～6年生黃芪根圍病土和健土的脲酶活性均呈逐漸降低的趨勢，且除6年生黃芪外，1～5年生黃芪根圍病土的脲酶活性均顯著低于健土（圖1）。同時(shí)，1～4 a 間隨著發(fā)病率的升高，病土與健土中脲酶活性的相對減少量呈遞增趨勢；第5年發(fā)病率繼續(xù)升高，酶活減少量卻開始降低；第6年發(fā)病率降低，二者的變化趨于一致（圖2）。可見，根腐病的發(fā)生對土壤中脲酶的活性有顯著影響，特別是1～4 a間病害發(fā)生率與脲酶活性的降低量呈正相關(guān)。第5，6年，病土中的脲酶活性逐漸恢復(fù)，且與第6年黃芪根腐病發(fā)病率降低的現(xiàn)象吻合。

2.3 黃芪根圍發(fā)病和健康土壤中纖維素酶活性的差異分析

纖維素酶主要參與簡單易分解含碳化合物的轉(zhuǎn)化，能將纖維素水解為纖維二糖，纖維二糖在纖維二糖酶的作用下可再分解為葡萄糖。研究結(jié)果顯示，1～6年生黃芪根圍病土中的纖維素酶活性均顯著高于健土（圖3），且1～4 a 間隨發(fā)病率的上升，病土與健土中纖維素酶活性的相對增加量也逐漸升高；第5年發(fā)病率繼續(xù)升高，但纖維素酶活性的增加量開始顯著降低，第6年二者變化趨勢又達(dá)一致（圖4），呈正相關(guān)?？梢姡〉陌l(fā)生對土壤中纖維素酶的活性也影響明顯，1～4 a 間發(fā)病率與纖維素酶活性的增加量呈正相關(guān)；第5，6年病土中纖維素酶活性不斷降低，土壤狀態(tài)逐漸恢復(fù)，病害發(fā)生情況也在第6年得以改觀。

2.4 黃芪根圍發(fā)病和健康土壤中蔗糖酶活性差異分析

蔗糖酶是與土壤碳代謝相關(guān)的酶，它可以將蔗糖水解成葡萄糖和果糖。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，1年生黃芪病土與健土中的蔗糖酶活性無顯著變化，2～4 a時(shí)該酶活性在病土中顯著高于健土，第5年活性開始降低至與健土持平，第6年則顯著低于健土（圖5）。蔗糖酶活性變化量和發(fā)病率的關(guān)系與纖維素酶的趨勢相同，即1～4 a間隨發(fā)病率的上升，病土與健土中蔗糖酶活性的相對增加量逐漸升高；第5年發(fā)病率繼續(xù)升高，但蔗糖酶活性的增加量顯著降低，第6年二者變化趨勢達(dá)到一致（圖6）。同樣可知，根腐病的發(fā)生對土壤中蔗糖酶的活性影響明顯，1～4 a 間發(fā)病率與蔗糖酶活性的增加量呈正相關(guān)；第5，6年病土中酶活性明顯降低，土壤狀態(tài)逐漸恢復(fù)，發(fā)病率也在第6年降低。

2.5 黃芪根圍發(fā)病和健康土壤中過氧化氫酶活性的差異分析

過氧化氫酶是一種保護(hù)酶，可以促進(jìn)過氧化氫的分解，防止其對植物體產(chǎn)生毒害。在本試驗(yàn)中過氧化氫酶的活性變化不規(guī)律，呈波浪式起伏。1年生黃芪病土和健康土壤的過氧化氫酶活性無差異，第2，4，6年健土顯著低于病土，第3，5年健土顯著高于病土（圖7）。黃芪根腐病的發(fā)病率與該酶的活性變化量也無關(guān)聯(lián)（圖8）。

3 結(jié)論與討論

土壤酶是表征土壤中物質(zhì)、能量代謝旺盛程度土壤質(zhì)量水平的一個(gè)重要生物指標(biāo)[11]。脲酶、纖維素酶、蔗糖酶和過氧化氫酶在土壤氮、碳等養(yǎng)分的循環(huán)和轉(zhuǎn)化及代謝有害物質(zhì)方面發(fā)揮著重要作用。

本研究中，1～4年生黃芪根圍病土中脲酶活性顯著低于健土，且其降低量與發(fā)病率呈正相關(guān)。這與游春梅等[7]對三七根腐病、WANG 等[12]對煙草枯萎病的研究結(jié)果一致。脲酶是參與土壤氮素循環(huán)和轉(zhuǎn)化的重要酶，對土壤中氮素的含量變化表現(xiàn)敏感[13]。有研究表明土壤脲酶活性的高低關(guān)乎作物生長的土壤肥力狀況，而土壤肥力又與作物生長狀況相關(guān)[14]。1～4年生黃芪病土中脲酶活性的降低量逐年加大，說明土壤中氮代謝水平越來越低，可能導(dǎo)致土壤氮素營養(yǎng)不足，使植株易于發(fā)病。

黃芪根腐病的發(fā)生對土壤中蔗糖酶和纖維素酶的活性也產(chǎn)生了顯著影響。1～4年生黃芪病土中蔗糖酶和纖維素酶活性的增加量與發(fā)病率均呈正相關(guān)。蔗糖酶活性的變化與孫雪婷等[15]研究結(jié)果一致，即三七病土的蔗糖酶活性高于健土。纖維素酶活性的變化則與青稞根腐病的發(fā)生導(dǎo)致土壤中纖維素酶活性上升一致[16]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，土壤微生物是土壤酶的主要來源，它們的數(shù)量和種群結(jié)構(gòu)影響土壤酶的活性[17]，如纖維素分解菌的大量減少會(huì)影響纖維素酶的活性[18]，此外，其代謝產(chǎn)物（酚酸及蔗糖類碳水化合物）也會(huì)導(dǎo)致蔗糖酶活性發(fā)生變化[15]。

山西大學(xué)中藥材病害研究課題組研究發(fā)現(xiàn)，在1～4年生的黃芪根圍土壤中，微生物總量均為病土顯著高于健土。其中，細(xì)菌是最重要的變化因子。酶系統(tǒng)是土壤中活躍的部分，土壤酶和土壤微生物一起共同推動(dòng)土壤的代謝過程[19]。由此推測，黃芪根圍病土中蔗糖酶和纖維素酶活性升高可能與微生物數(shù)量變化有關(guān)。然而，也有與上述結(jié)果相反的結(jié)論，如青稞根腐病病株根際土壤的蔗糖酶活性普遍下降2%～7%[16]。這可能與不同試驗(yàn)區(qū)土壤狀況不同、且不同作物對土壤酶活性的影響也不同有關(guān)，但具體機(jī)制還有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

另外，上述3 種酶在第5年的發(fā)病土壤中都呈現(xiàn)出了酶活變化與發(fā)病率相反的趨勢，但在第6年，活性變化趨勢又與發(fā)病率降低相吻合。據(jù)報(bào)道，土壤酶在遭遇土壤環(huán)境變化的情況下，可產(chǎn)生一些抗逆機(jī)制來維持自身的穩(wěn)定性，其生物適應(yīng)性也會(huì)隨之呈現(xiàn)出先弱后強(qiáng)[20]。酶活性隨黃芪發(fā)病程度的變化（升高—最重—降低）而呈現(xiàn)出的規(guī)律，說明黃芪根圍土壤可能具有一定的恢復(fù)機(jī)制。

綜上，黃芪根腐病的發(fā)生對土壤中脲酶、蔗糖酶和纖維素酶的活性產(chǎn)生了顯著影響，且土壤酶活性的變化與發(fā)病率相關(guān)，故這3 種酶可作為評判黃芪種植地土壤健康狀況的參考指標(biāo)，而過氧化氫酶活性變化與病害發(fā)生無明顯關(guān)聯(lián)。但是，本試驗(yàn)?zāi)壳爸煌瓿闪? 個(gè)主要土壤酶活性的測定，若要全面了解土壤酶活性與根腐病發(fā)生的關(guān)系，還需繼續(xù)完善研究內(nèi)容，并進(jìn)一步探索土壤微生物變化與各類酶活性之間的關(guān)系。