HPLC 法同時(shí)測(cè)定斑蝥中3 種核苷類(lèi)成分

陳啟洪， 段燦燦， 李曉飛， 張建永?

（1. 遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 貴州 遵義 563009； 2. 遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室， 貴州 遵義 563009； 3. 貴州省普通高等學(xué)校特色藥物腫瘤防治特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563009）

斑蝥為節(jié)肢動(dòng)物門(mén)昆蟲(chóng)綱芫菁科昆蟲(chóng)南方大斑蝥Mylabris phalerata Pallas 或黃黑小斑蝥Mylabris cichorii Linnaeus 的干燥體， 始載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》， 其性辛、熱， 有大毒， 歸肝、 胃、 腎經(jīng)， 具破血逐瘀、 散結(jié)消癥等功效， 用于癥瘕、 頑癬等頑疾[1-2］。 現(xiàn)代研究表明，斑蝥主要成分為斑蝥素類(lèi)， 具有抗腫瘤和抗病毒的作用， 此外還含有蛋白質(zhì)、 氨基酸、 脂肪及脂肪酸、 核苷類(lèi)、 微量元素等[3-5］。 目前， 斑蝥的質(zhì)量控制及藥理活性研究主要集中在斑蝥素上， 而對(duì)其中核苷類(lèi)成分的報(bào)道較少， 其作為生物細(xì)胞維持生命活動(dòng)的基本組成元素， 參與DNA 代謝過(guò)程， 具有抗腫瘤、 抗病毒、 基因治療等多種生物活性， 所具有較強(qiáng)活性使其成為熱點(diǎn)[6-9］。 貴州省作為斑蝥的重要產(chǎn)地， 具有豐富的資源，研究表明產(chǎn)于黔南布依族苗族自治州羅甸縣的南方大斑蝥和黃黑小斑蝥體內(nèi)的結(jié)合斑蝥素對(duì)人肝癌HepG2 細(xì)胞增殖抑制作用明顯優(yōu)于其他地區(qū)同種斑蝥， 是貴州優(yōu)良地域種[10-11］。 因此， 本研究采用HPLC 法對(duì)斑蝥中核苷類(lèi)成分進(jìn)行檢測(cè)， 同時(shí)測(cè)定貴州省羅甸縣不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)及來(lái)源斑蝥中該成分， 以期為該昆蟲(chóng)多指標(biāo)質(zhì)量控制及核苷類(lèi)成分合理開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

EClassical 3100 高效液相色譜儀（自動(dòng)進(jìn)樣器、 柱恒溫箱、 可變波長(zhǎng)檢測(cè)器） （大連依利特公司）； BT125D 型電子天平（十萬(wàn)分之一， 德國(guó)賽多利斯公司）； Aquelix 超純水處理器（美國(guó)Millipore 公司）； RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）； BCD-579WE 冰箱（青島海爾股份有限公司）； SG3300HE 超聲儀（上海冠特超聲儀器有限公司）。 尿 嘧 啶 （AB0542， 含 有 量＞98%）、 次 黃 嘌 呤（AB0366， 含有量＞98%） 對(duì)照品均購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司； 尿嘧啶核苷（PS16091802， 含有量＞98%） 對(duì)照品購(gòu)自成都普斯生物科技有限公司。 甲醇、 冰醋酸為色譜純； 無(wú)水乙醇為分析純。

斑蝥均采自貴州， 經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院李曉飛教授鑒定為芫菁科昆蟲(chóng)南方大斑蝥（大斑芫菁， Mylabris phalerata Pallas）或黃黑小斑蝥（小斑芫菁， Mylabris cichorii Linnaeus） 的干燥體。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[12］Phenimenex Synergl 4 μm Polar-RP80A柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相1%冰醋酸（A） -甲醇（B）， 梯度洗脫， 程序見(jiàn)表1； 體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm； 檢測(cè)時(shí)間30 min； 進(jìn)樣量20 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黃嘌呤各約5.0 mg， 精密稱(chēng)定， 置于10 mL 量瓶中， 加純水溶解并定容， 即得。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱(chēng)定昆蟲(chóng)粉末約2.5 g， 加50 mL 75%乙醇回流提取2 次， 每次1.5 h， 合并2 次濾液，水浴揮干乙醇， 冷卻， 加水補(bǔ)足到100 mL， 放置水沉24 h， 抽濾除沉淀， 將樣品溶液減壓濃縮冷卻后加水定容至25 mL量瓶中， 搖勻， 過(guò)0.22 μm 微孔濾膜， 即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取純水， 尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黃嘌呤對(duì)照品溶液， 供試品溶液適量， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。 結(jié)果， 在與尿嘧啶、 尿苷、 次黃嘌呤對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的保留時(shí)間處， 供試品溶液色譜圖中有三者吸收峰， 空白溶劑色譜圖中未顯示對(duì)應(yīng)的色譜峰， 表明空白溶劑無(wú)干擾， 各峰分離度＞1.5， 色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液560、 480、 400、 320、 240、 160、 80、 4 μL 于2 mL 量瓶中， 加純水補(bǔ)足2 mL 稀釋至140、 120、 100、 80、 60、 40、20、 1 μg／mL， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。 以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）， 峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，見(jiàn)表2， 可知尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黃嘌呤在各自范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

表2 各成分線(xiàn)性關(guān)系

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次， 測(cè)得尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黃嘌呤峰面積RSD 分別為0.13%、 0.56%、 0.38%， 表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一斑蝥（八總鄉(xiāng)黃黑小斑蝥） 6份， 按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黃嘌呤含有量RSD 分別為3.04%、 2.97%、 2.80%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（八總鄉(xiāng)黃黑小斑蝥）， 于室溫放置0、 2、 4、 8、 12、 24 h 后在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黃嘌呤峰面積RSD 分別為0.52%、 0.79%、 0.38%， 表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取同一核苷類(lèi)成分含有量已知的斑蝥（八總鄉(xiāng)黃黑小斑蝥） 1.25 g， 精密加入對(duì)照品溶液，使其加入量分別相當(dāng)于各對(duì)照品含有量的50%、 100%、150%， 按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備3 份供試品溶液（共9份）， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 計(jì)算回收率， 結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.4 樣品含有量測(cè)定 取羅甸不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)和來(lái)源斑蝥， 按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 計(jì)算含有量， 結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg／g）

3 討論

3.1 核苷類(lèi)組分確認(rèn) 目前斑蝥含有量測(cè)定主要集中在其脂溶性成分上， 如2015 版《中國(guó)藥典》 一部選擇斑蝥素，此外有學(xué)者建立了斑蝥脂肪油中棕櫚酸、 棕櫚油酸、 硬脂酸、 油酸、 亞油酸、 亞麻酸、 花生酸共7 種脂肪酸含有量的測(cè)定方法[13］， 可用于其脂溶性部位的質(zhì)量控制。 在水溶性成分上， 有學(xué)者采用毛細(xì)管氣相色譜法建立了斑蝥中天冬氨酸、 谷氨酸、 絲氨酸、 組氨酸、 甘氨酸、 蘇氨酸、 脯氨酸、 丙氨酸、 纈氨酸、 蛋氨酸、 異亮氨酸、 亮氨酸、 精氨酸、 苯丙氨酸、 賴(lài)氨酸等15 種氨基酸含有量的測(cè)定方法[14］， 并用于斑蝥的炮制研究； 有學(xué)者采用原子吸收光譜法建立了斑蝥藥材中鐵、 錳、 銅、 鋅、 砷等微量元素的含有量測(cè)定方法等用于質(zhì)量控制[15］； 然而關(guān)于核苷類(lèi)成分的質(zhì)量分析報(bào)道較少， 目前僅有一篇報(bào)道了斑蝥指紋圖譜，并發(fā)現(xiàn)了尿嘧啶核苷[16］。 為此， 本研究首先通過(guò)HPLC 分析， 探索腺嘌呤、 腺嘌呤核苷、 2′-脫氧腺苷、 雙脫氧腺苷、 鳥(niǎo)嘌呤、 鳥(niǎo)嘌呤核苷、 脫氧鳥(niǎo)苷、 黃嘌呤、 次黃嘌呤、次黃嘌呤核苷、 胞嘧啶、 胞嘧啶核苷、 胸腺嘧啶、 胸腺嘧啶核苷、 尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 2′-脫氧尿苷、 蟲(chóng)草素18 種中藥中常見(jiàn)的核苷類(lèi)成分[7-9，17-19］在斑蝥中是否存在， 最終確認(rèn)尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黃嘌呤。

3.2 樣品處理及色譜條件篩選 在供試品溶液制備方法研究中， 本實(shí)驗(yàn)考察了超聲、 回流提取， 發(fā)現(xiàn)回流提取能得到更多核苷類(lèi)成分。 然后， 考察了不同酸（磷酸、 甲酸、冰醋酸） 及其比例（0.5%、 1%、 2%） 對(duì)色譜峰分離的影響， 結(jié)果顯示1%冰醋酸具有較好的分離效果。

3.3 含有量測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 羅甸不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)之間斑蝥各成分含有量差異較大， 表明即使是近產(chǎn)區(qū)質(zhì)量也可能存在差異； 但同一鄉(xiāng)鎮(zhèn)的南方大斑蝥和黃黑小斑蝥之間差異較小， 提示產(chǎn)地對(duì)其質(zhì)量影響可能較大。 在所測(cè)定的各核苷類(lèi)成分中， 尿嘧啶含有量為0.16 ～0.71 mg／g， 尿嘧啶核苷含有量為0.71～1.21 mg／g， 次黃嘌呤含有量為0.47～1.07 mg／g， 其中尿嘧啶以沫陽(yáng)鎮(zhèn)黃黑小斑蝥最高， 尿嘧啶核苷以八總鄉(xiāng)黃黑小斑蝥最高， 次黃嘌呤以紅水河鎮(zhèn)黃黑小斑蝥最高， 尿嘧啶差異最高可達(dá)4 倍。 在3 種核苷類(lèi)成分總含有量方面， 紅水河鎮(zhèn)黃黑小斑蝥為2.44 mg／g， 整體優(yōu)于其他鄉(xiāng)鎮(zhèn)和來(lái)源的樣品， 并接近藥典規(guī)定的斑蝥素（3.5 mg／g）[20］， 可能與后者抗腫瘤、 抗病毒功效有協(xié)同作用， 因此對(duì)其質(zhì)量控制是有必要的。

綜上所述， 本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC 法能用于分析3 種核苷類(lèi)成分， 其準(zhǔn)確性、 重復(fù)性和穩(wěn)定性良好， 適用于斑蝥中尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黃嘌呤含有量的測(cè)定， 對(duì)相關(guān)研究及多指標(biāo)成分質(zhì)量控制具有重要意義。