癲癇清顆粒對海人藻酸致癲癇大鼠行為學(xué)變化及NF-κB 信號通路的影響

齊 越， 賈 冬， 李紀(jì)彤， 姜 鴻， 秦文艷， 韋 丹， 張冰冰， 康 凱，陳 賀?

（1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬二院， 遼寧 沈陽 110034； 2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 沈陽 110847； 3. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院， 遼寧 沈陽 110032）

近年來臨床研究及動物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)， 癲癇與炎癥的關(guān)系密不可分， 炎癥反應(yīng)可降低癇性發(fā)作閾值， 增加神經(jīng)元興奮性， 破壞血腦屏障， 介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡及突觸重塑[1-2］。另外， 核因子-κB （NF-κB） 廣泛分布于腦內(nèi)多種細(xì)胞中，作為調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子也與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。

癲癇清顆粒為遼寧省中醫(yī)藥研究院的院內(nèi)制劑， 前期研究顯示它可延長戊四唑及海人藻酸大鼠癲癇發(fā)作潛伏期，降低發(fā)作分級和持續(xù)時間， 增加腦組織白介素-4 （IL-4）水平， 抑制小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化[3-8］。 本實(shí)驗(yàn)以海馬內(nèi)注射海人藻酸誘導(dǎo)癲癇大鼠模型， 考察癲癇清顆粒是否通過NF-κB 信號通路發(fā)揮抗炎作用， 進(jìn)而對大鼠行為學(xué)產(chǎn)生影響， 從多方面多角度揭示該制劑抗癲癇作用機(jī)制，為臨床用藥提供必要的藥理學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性Wistar 大鼠60 只， 體質(zhì)量（200±20） g， 由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供， 動物生產(chǎn)許可證號SCXK （遼） 2010-0001， 自由進(jìn)食及飲水。

1.2 藥物 癲癇清顆粒（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，批號20140110， 5.31 g 生藥／kg）； 苯妥英鈉片（天津力生制藥股份有限公司， 批號1312027， 每片素片重0.1 g）。 海人藻酸（美國Sigma 公司， 批號MKBQ0 979 V， 含有量大于98%）； 水合氯醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司， 批號20100709）； NF-κB p65、 p-IκB、 IκB、 β-actin 試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀器 DW-5 腦立體定位儀（成都泰盟科技有限公司）； Stronger90 牙 科 鉆 （韓 國 世 新 精 密 株 式 會 社）；Neofuge13R 高速冷凍離心機(jī)（上海力申科學(xué)儀器有限公司）； Mini-PROTEAN?Tetra Cell 垂直電泳系統(tǒng)（美國伯樂有限公司）。

2 方法

2.1 分組與給藥 60 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、 模型組、苯妥英鈉組及癲癇清顆粒低、 中、 高劑量組， 每組10 只，分籠飼養(yǎng)， 自由攝食飲水。 根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果并結(jié)合文獻(xiàn)[10］， 設(shè)置癲癇清顆粒低、 中、 高劑量分別為4.74、9.47、 18.94 g／kg， 苯妥英鈉劑量為0.03 g／kg， 各組大鼠給藥量為20 mL／kg， 灌胃給藥， 每天1 次， 連續(xù)7 d， 假手術(shù)組、 模型組大鼠給予等體積蒸餾水。

2.2 模型建立 采用前期課題組報道方法[6］。 第7 天給藥結(jié)束后1 h， 350 mg／kg 水合氯醛麻醉大鼠， 將其固定于腦立體定位儀上， 頭部備皮， 碘伏消毒2 次， 于顱頂正中線作一3～4 cm 切口， 鈍性分離骨膜， 將囟門定位為零點(diǎn)，輕輕移動微量進(jìn)樣器， 中線旁開2.20 mm、 后3.00 mm，制作標(biāo)記點(diǎn)， 垂直使用牙科鉆， 輕鉆至穿破骨膜， 垂直進(jìn)針約3.70 mm， 3 min 內(nèi)緩慢勻速注入1.0 μL 海人藻酸（1 μg／μL）， 留針5 min， 假手術(shù)組大鼠注射等體積生理鹽水。 手術(shù)結(jié)束后， 縫合大鼠腦部肌肉及皮膚， 碘伏消毒2次， 整個手術(shù)過程注意保暖。

2.3 癲癇清顆粒對大鼠行為超興奮性的影響[9］

2.3.1 接近反應(yīng)實(shí)驗(yàn) 用筆垂直、 緩慢地從大鼠面前經(jīng)過， 觀察其表現(xiàn)， 然后進(jìn)行評分， 評分標(biāo)準(zhǔn)： ①無反應(yīng)；②大鼠嗅此筆； ③大鼠離開此筆； ④大鼠凍結(jié)； ⑤大鼠跳離此筆； ⑥大鼠跳向此筆或是襲擊此筆。

2.3.2 響指反應(yīng)實(shí)驗(yàn) 在離大鼠頭部幾厘米處發(fā)出響指聲， 觀察其反應(yīng)， 然后進(jìn)行評分， 評分標(biāo)準(zhǔn)： ①無反應(yīng)；②大鼠輕輕跳躍或退縮或突然搖耳朵； ③大鼠大跳。

2.4 大鼠海馬IκB／NF-κB 蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot 法。 末次給藥1 h 后， 每組隨機(jī)選取5 只大鼠， 迅速斷頭處死后冰盤上分離海馬， 稱定質(zhì)量， 提取總蛋白， BSA法測定蛋白濃度， 10% 凝膠電泳， 轉(zhuǎn)膜， 5% 脫脂牛奶封閉， 一抗孵育， 4 ℃下靜置過夜， PBS 洗滌后加入二抗孵育， 再次洗滌后加入超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒， 凝膠成像系統(tǒng)觀察相關(guān)蛋白的表達(dá)， Quantity One 4.6.2 圖像分析軟件進(jìn)行分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 13.0 軟件進(jìn)行處理， 數(shù)據(jù)用±s） 表示， 組間比較采用單因素方差分析。 P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠死亡情況 海人藻酸注射后， 模型組、 苯妥英鈉組及癲癇清顆粒低、 中、 高劑量組大鼠分別死亡3、 2、 3、2、 2 只。

3.2 癲癇清顆粒對大鼠行為學(xué)的影響 表1 顯示， 與假手術(shù)組比較， 模型組大鼠接近反應(yīng)、 響指反應(yīng)評分顯著增加（P＜0.01）； 與模型組比較， 癲癇清顆粒組兩者顯著降低（P＜0.01）。

表1 癲癇清顆粒對大鼠行為學(xué)的影響）

表1 癲癇清顆粒對大鼠行為學(xué)的影響）

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01

組別 動物數(shù)／只劑量／（g·kg-1）接近反應(yīng)評分響指反應(yīng)評分假手術(shù)組 10 — 1.35±0.28 1.62±0.50模型組 7 — 2.16±0.41## 2.31±0.42##苯妥英鈉組 8 0.03 1.52±0.32?? 1.59±0.43癲癇清顆粒組 7 4.74 1.81±0.29?? 1.39±0.29??癲癇清顆粒組 8 9.47 1.54±0.31?? 1.52±0.22??癲癇清顆粒組 8 18.94 1.49±0.21?? 1.68±0.11??

3.3 癲癇清顆粒對大鼠p-IκB／IκB／NF-κB P65 表達(dá)的影響 圖1、 表2 顯示， 與假手術(shù)組比較， 模型組大鼠海馬組織p-IκB、 NF-κB P65 表達(dá)顯著增加（P＜0.01）， IκB 表達(dá)顯著減少（P＜0.05）； 與模型組比較， 癲癇清顆粒中劑量組僅IκB 表達(dá)顯著增加（P ＜0.01）， 而高劑量組p-IκB、NF-κB P65 表達(dá)顯著減少（P＜0.05， P＜0.01）， IκB 表達(dá)顯著增加（P＜0.01）。

4 討論

圖1 癲癇清顆粒對大鼠p-IκB／IκB／NF-κB P65 表達(dá)的影響

表2 癲癇清顆粒對大鼠p-IκB／IκB／NF-κB P65 表達(dá)的影響 ±s， n=5）

表2 癲癇清顆粒對大鼠p-IκB／IκB／NF-κB P65 表達(dá)的影響 ±s， n=5）

注：與假手術(shù)組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1）p-IκB／β-actin IκB／β-actin NF-κB P65／β-actin假手術(shù)組 — 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00模型組 — 2.08±0.12??0.52±0.12? 1.92±0.12?苯妥英鈉組 0.03 1.41±0.21# 1.12±0.22# 1.26±0.21#癲癇清顆粒組 4.74 1.97±0.31 0.76±0.21 1.83±0.19癲癇清顆粒組 9.47 1.83±0.11 1.22±0.17## 1.53±0.11癲癇清顆粒組 18.94 1.23±0.18## 1.38±0.20## 1.17±0.153#?

大量研究表明， 癲癇是由于大腦神經(jīng)元異常放電導(dǎo)致的腦電活動不平衡所致[10］， 而且常伴有一定程度的認(rèn)知問題和適應(yīng)障礙（如記憶困難、 注意力不集中、 睡眠不好、抑郁等）[11-12］。 2016 年一項(xiàng)研究表明， 高達(dá)50%的癲癇患者可能還具有異常行為， 如敵意、 沖動、 煩躁、 激動、 憤怒和攻擊行為等[13］， 推測其可能與腦內(nèi)興奮和抑制的失衡有關(guān)。

目前， 在癲癇行為學(xué)研究的模型中藥物主要有匹魯卡品和海人藻酸， 動物大多為大、 小鼠， 可用評估實(shí)驗(yàn)包括高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)、 明／暗實(shí)驗(yàn)、 曠場測試、 強(qiáng)迫游泳測試、 行為超興奮性測試、 鼠尾懸停測試、 孔板測試、 MK-801 （地佐昔康） 誘導(dǎo)精神病樣行為等， 其中行為超興奮性測試中包括響指反應(yīng)、 接近反應(yīng)、 快速反應(yīng)、 拾取反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)在大鼠腦內(nèi)CA1 區(qū)注射海人藻酸， 并考察癲癇清顆粒對大鼠行為超興奮性的影響， 發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較， 模型組響指反應(yīng)、 接近反應(yīng)評分明顯增加， 表明大鼠腦內(nèi)CA1 區(qū)注射1.0 μg 海人藻酸可較好地模擬癲癇動物模型行為學(xué)變化； 與模型組比較， 癲癇清顆粒組可明顯降低2 種評分， 表明它可較好地改善癲癇大鼠腦內(nèi)興奮性、 抑制性的失衡關(guān)系。

炎癥與多種神經(jīng)疾病密切相關(guān)， 如癲癇、 帕金森病、阿爾茨海默病、 中風(fēng)等， 過去十年中炎癥在癲癇病因中的重要作用引起了眾多學(xué)者廣泛關(guān)注， 支持炎性過程在癲癇中發(fā)揮潛在作用的關(guān)鍵證據(jù)來源于（1） 人類耐藥性癲癇的治療中， 抗炎藥物可發(fā)揮一定抗癲癇作用； （2） 在手術(shù)切除難治性癲癇患者的腦組織中， 可見炎性幾種介質(zhì)；（3） 癲癇發(fā)作可促使腦內(nèi)免疫細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生； （4） 自發(fā)性癲癇可導(dǎo)致永久性慢性炎癥， 故抑制炎癥因子表達(dá)可能對癲癇有治療作用。

核因子-κB （NF-κB） 作為調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子， 主要在腦內(nèi)的神經(jīng)元、 星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞中存在， 并參與炎癥基因的表達(dá)、 細(xì)胞存活、 凋亡[14］， 當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時， 它與抑制性蛋白IκB 結(jié)合， 存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)； 激活后， 其蛋白磷化后發(fā)生降解， 促使其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)， 進(jìn)一步激活靶基因， 調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)， 如iNOS、 COX-2、TNF-α、 IL-4 等[15-16］。 研究表明， 在慢性癲癇患者致癇灶的腦組織病理切片中可見膠質(zhì)細(xì)胞活化、 增生、 NF-κB 過表達(dá)[17］； 癲癇動物模型中也可見小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB 信號通路激活， 并伴隨著炎癥因子含量的增加， 可知NF-κB 參與了癲癇發(fā)病過程中的炎癥信號通路的激活， 抑制其活化，可能成為干預(yù)癲癇發(fā)生發(fā)展的潛在治療靶點(diǎn)。 前期課題組研究表明， 癲癇清顆?？梢种菩∧z質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化[8］， 增加抗炎因子IL-4 表達(dá)[6］， 但具體作用機(jī)制尚不清楚； 本實(shí)驗(yàn)考察了癲癇清顆粒對NF-κB 信號通路的影響， 發(fā)現(xiàn)它可面向減少p-IκB、 NF-κB P65 表達(dá)， 抑制IκB降解， 可能通過抑制NF-κB 信號通路、 調(diào)控炎癥因子表達(dá)來改善癲癇超興奮行為， 從而發(fā)揮抗癲癇作用。