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    圣科健骨膠囊對大鼠血清差異蛋白的影響

    2019-06-01 02:50:52幺寶金果淑鳳袁勁松趙大慶
    中成藥 2019年4期
    關(guān)鍵詞:絲氨酸膠囊因子

    幺寶金, 果淑鳳, 袁勁松, 劉 佳, 趙大慶?

    (1. 長春中醫(yī)藥大學(xué), 吉林省人參科學(xué)研究院, 吉林 長春 130117; 2. 北京世紀(jì)圣科科技發(fā)展有限公司,北京 100010; 3. 長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 吉林 長春 130117)

    圣科健骨膠囊是由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院和中國疾病預(yù)防控制中心專家結(jié)合國際上防治骨質(zhì)疏松癥的最新科研成果研制而成的保健產(chǎn)品, 作為健骨類產(chǎn)品在市場上銷售多年, 取得了良好療效, 該制劑從骨代謝本質(zhì)入手, 遵循“補骨、 修骨和養(yǎng)骨”三位一體理論, 將國際公認(rèn)的高效健骨因子與納米鈣、 活化維生素D3、 微量元素等多種骨營養(yǎng)素按照一定比例復(fù)合而成, 通過調(diào)節(jié)內(nèi)分泌可有效促進(jìn)骨基質(zhì)生成, 達(dá)到補充骨量、 修復(fù)損傷骨組織、 養(yǎng)護(hù)骨骼的功效。 本實驗采用同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)定性定量(iTRAQ) 分析技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析方法, 對圣科健骨膠囊給藥后大鼠血清蛋白組進(jìn)行差異表達(dá)分析, 以期揭示其健骨功效的內(nèi)在分子機制。

    1 材料

    清潔級雌性SD 大鼠40 只, 體質(zhì)量(220±20) g,購于長春市億斯實驗動物技術(shù)有限公司, 實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK (吉) -2016-0003。 圣科健骨膠囊由北京世紀(jì)圣科科技發(fā)展有限公司提供, 主要由高效健骨因子與納米鈣、 活化維生素D3、 微量元素等多種骨營養(yǎng)素按照一定比例復(fù)合而成。 ProteoMiner 低豐度蛋白富集試劑盒購于美國Bio-Rad公司; iTRAQ 蛋白標(biāo)記試劑盒購于美國AB Sciex公司。 二硫蘇糖醇、 碘乙酰胺、 三乙基碳酸氫銨、胰蛋白酶等為分析純, 購于美國Sigma 公司。 乙腈、 甲醇為色譜純, 購于美國Thermo 公司; 其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    2 方法

    2.1 蛋白提取制備

    2.1.1 給藥及血清采集 將大鼠隨機分為空白組和給藥組, 每組20 只, 給藥組給予1 g/kg 圣科健骨膠囊生理鹽水混懸液, 空白組給予等體積生理鹽水, 每天灌胃給藥1 次, 連續(xù)3 周。 末次灌胃給藥次日, 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉, 頸總動脈收集血液, 4 ℃靜置2 h, 2 000×g 離心5 min, 收集上清液, 10 000×g 離心10 min, 收集血清, 血清組分保存于-80 ℃下。

    2.1.2 蛋白富集及酶解 將空白組、 給藥組血清分別合并, 經(jīng)ProteoMiner 低豐度蛋白富集試劑盒去除免疫球蛋白和白蛋白等高豐度蛋白, 采用Bradford 法測定蛋白濃度。 取2 組血清蛋白各100 μg, 加入10 mmol/L 二硫蘇糖醇, 37 ℃下還原處理1 h 后加入20 mmol/L 碘乙酰胺烷化處理45 min, 再加入5 μg 胰蛋白酶, 37 ℃下酶解4 h后再補加5 μg 繼續(xù)酶解8 h, 凍干。

    2.1.3 蛋白酶解、 標(biāo)記和純化 將酶解蛋白凍干粉溶于0.5 mol/L 三乙基碳酸氫銨中, iTRAQ 蛋白標(biāo)記試劑盒進(jìn)行酶解蛋白標(biāo)記, 島津LC-20AB 液相系統(tǒng)進(jìn)行肽段分離。 分析采用Ultremex SCX 層析柱(美國Phenomenex 公司); 洗脫液Buffer A,pH 2.7, 含25 mmol/L 磷酸二氫鉀和25% 乙腈;Buffer B, pH 2.7, 含25 mmol/L 磷 酸 二 氫 鉀、1 mol/L氯化鉀和25% 乙腈, 洗脫條件為Buffer A 10 min, 5% ~35% Buffer B 11 min, 35% ~80%Buffer B 1 min; 吸收波長214 nm。 收集不同組分,經(jīng)Strata X 層析柱除鹽后凍干。

    2.1.4 液質(zhì)鑒定及生物信息學(xué)分析 通過超高液相色譜nanoACQUITY 聯(lián)合質(zhì)譜TripleTOF 5600 技術(shù)進(jìn)行肽段鑒定, 采用Symmetry C18、 BEH130 C18色譜柱(美國Waters 公司); 流動相A 液為水-乙腈-甲酸 (98 ∶ 2 ∶ 0.1), B 液 為 水-乙 腈-甲 酸(2 ∶98 ∶0.1); 洗脫條件為A 液15 min, 5%B 液1 min, 5% ~35% B 液40 min, 35% ~80% B 液5 min, 80%B 液5 min; 質(zhì)譜參數(shù)反射掃描, 分辨率3.0×104以上; 脈沖頻率11 kHz; 碰撞能量(35±5 eV)。 然后, 通過ProteinPilot 5.0 軟件(美國AB Sciex 公司) 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析, 蛋白鑒定錯誤率FDR≤1%, 當(dāng)2 組樣品蛋白質(zhì)豐度差異倍數(shù)≥1.5 倍或≤0.67 倍, 且P<0.05 時可認(rèn)定為差異蛋白, 其功能富集采用AmiGO 進(jìn)行分析。

    3 結(jié)果

    3.1 血清差異蛋白功能富集分析 共鑒定出237 種表達(dá)蛋白, 與空白組比較, 給藥組顯著上調(diào)的差異蛋白(差異倍數(shù)≥1.5 倍, P<0.05) 有130 種, 顯著下調(diào)的(差異倍數(shù)≤0.67 倍, P <0.05) 有107種。 針對這些差異蛋白, 首先進(jìn)行功能富集分析,包括細(xì)胞組分、 分子功能、 生物進(jìn)程3 種功能分類。

    在細(xì)胞組分功能分類中, 差異蛋白主要歸類為細(xì)胞外區(qū)域、 皮質(zhì)肌動蛋白細(xì)胞骨架、 蛋白酶體核心復(fù)合物、 肌動蛋白絲、 肌動球蛋白等, 具體見表1。

    表1 血清差異蛋白細(xì)胞組分富集分析(P<0.05)Tab.1 Cellular component enrichment analysis of serum differential proteins (P<0.05)

    在分子功能分類中, 差異蛋白主要歸類為肽酶調(diào)節(jié)劑活性、 抗原結(jié)合、 肽酶抑制劑活性、 酶抑制劑活性、 過氧化物酶活性、 絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶抑制劑活性等, 具體見表2。

    在生物進(jìn)程分類中, 差異蛋白主要歸類為蛋白水解調(diào)節(jié)、 外源刺激反應(yīng)調(diào)節(jié)、 壓力反應(yīng)調(diào)節(jié)、 大分子復(fù)合物亞基組織、 肽鏈內(nèi)切酶活性調(diào)節(jié)、 肽酶活性調(diào)節(jié)等, 具體見表3。

    3.2 含藥血清健骨功效分子機制研究 基于“3.1” 項下結(jié)果, 對給藥后大鼠血清中顯著上調(diào)(差異倍數(shù)≥1.5 倍, P<0.05) 的差異蛋白作進(jìn)一步分析, 結(jié)果共篩選出14 種調(diào)控骨形成及骨質(zhì)密度的功能蛋白, 具體見表4, 主要包括Greb1 蛋白(Greb1)、 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶D3 (Prkd3)、張力蛋白 (Tns4)、 絲氨酸蛋白酶抑制劑A3M(Serpina3m)、 微管相關(guān)蛋白1 A (Map1a) 等。

    表2 血清差異蛋白分子功能富集分析(P<0.05)Tab.2 Molecular function enrichment analysis of serum differential proteins (P<0.05)

    3.3 含藥血清抗炎功效分子機制研究 基于“3.1” 項下結(jié)果, 對給藥后大鼠血清中顯著下調(diào)(差異倍數(shù)≤0.67 倍, P<0.05) 的差異蛋白作進(jìn)一步分析, 結(jié)果共篩選出12 種參與炎性反應(yīng)的功能蛋白, 具體見表5, 主要包括鋅指同源蛋白2(Zfhx2)、 NF-kappa-B 抑制劑zeta (Nfkbiz)、 激肽原-1 (Kng1)、 絲氨酸蛋白酶hepsin (Hpn) 等。

    4 討論

    本實驗采用iTRAQ 分析技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析方法, 對圣科健骨膠囊給藥后大鼠血清蛋白組進(jìn)行系統(tǒng)分析, 共鑒定出237 種差異蛋白。 功能富集分析結(jié)果表明, 這些差異蛋白主要為細(xì)胞外基質(zhì)、 細(xì)胞骨架蛋白、 蛋白酶體復(fù)合物等, 主要參與酶調(diào)節(jié)、 抗原結(jié)合、 蛋白水解調(diào)節(jié)、 外源刺激反應(yīng)調(diào)節(jié)、 壓力反應(yīng)調(diào)節(jié)、 大分子復(fù)合物亞基組織、 肽酶活性調(diào)節(jié)等生物進(jìn)程。

    表3 血清差異蛋白生物進(jìn)程富集分析(P<0.05)Tab.3 Biological process enrichment analysis of serum differential proteins (P<0.05)

    表4 含藥血清健骨功效差異蛋白分析Tab.4 Differential protein analysis of medicated serum for bone-invigorating effect

    表5 含藥血清抗炎功效差異蛋白分析Tab.5 Differential protein analysis of medicated serum for anti-inflammatory effect

    與空白組比較, 圣科健骨膠囊組顯著上調(diào)的差異蛋白主要包括Greb1、 Prkd3、 Tns4、 Serpina3m等調(diào)控骨形成及骨質(zhì)密度的功能蛋白。 其中,Greb1 作為雌激素調(diào)節(jié)通路的重要分子, 在成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞中表達(dá)量顯著上調(diào), 其遺傳變異與骨密度變化導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松密切相關(guān)[1-2]; Prkd3屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員, 是成骨細(xì)胞分化和礦化結(jié)節(jié)形成的重要調(diào)控因子[3]; Tns4屬于支架蛋白家族成員, 是細(xì)胞生長和遷移的重要調(diào)控因子, 主要通過觸發(fā)整聯(lián)蛋白與肌動蛋白細(xì)胞骨 架 的 解 偶 聯(lián) 來 實 現(xiàn)[4]; Serpina3m、 Serpina3l、Serpina3k 同屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑Serpina3 亞型, 可通過抑制局部絲氨酸蛋白酶濃度進(jìn)而調(diào)控骨髓造血微環(huán)境的動態(tài)平衡[5]; Map1a 屬于微管相關(guān)蛋白家族成員, 可通過調(diào)節(jié)微管組裝、 微管結(jié)構(gòu)及功能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化[6]; Prdx2 主要在骨髓基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá), 可有效阻止骨髓老化[7]; Prl是一種蛋白質(zhì)激素, 可減少破骨細(xì)胞形成和骨質(zhì)流失, 促進(jìn)骨形成[8]; Gpx1 是一種抗氧化酶, 主要調(diào)控細(xì)胞防御氧化損傷, 從而防止骨質(zhì)疏松癥等與年齡相關(guān)疾病的發(fā)生[9]; Epb41 最初被認(rèn)為是紅細(xì)胞膜分子, 主要負(fù)責(zé)維護(hù)細(xì)胞的完整性及膜骨架和跨膜蛋白之間的相互作用, 最近研究表明, 該基因缺失小鼠腸鈣吸收功能受損, 進(jìn)而導(dǎo)致繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)所致的骨鈣缺失[10]; 另外, 顯著上調(diào)的差異表達(dá)蛋白還包括具有抗炎、 抗感染、 排毒功效的功能蛋白, 如Ngp、 Cfp、 Ces1c 等[11-13]。 由此表明, 圣科健骨膠囊的健骨功效主要是通過上調(diào)以上參與調(diào)控骨密度和骨形成過程的功能蛋白來實現(xiàn)的。

    與空白組比較, 圣科健骨膠囊組顯著下調(diào)的差異 蛋 白 主 要 包 括 Zfhx2、 Nfkbiz、 Kng1、 Hpn、Prkcsh 等參與骨關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎炎性反應(yīng)的相關(guān)因子。 其中, Kng1 是一種高分子量激肽原,該基因缺失小鼠可有效拮抗PG-PS 所致骨關(guān)節(jié)炎炎性反應(yīng)及軟骨損傷[14]; Hpn 是一種絲氨酸蛋白酶, 大量研究表明蛋白水解級聯(lián)中的絲氨酸蛋白酶導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)如骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織的病理性損傷[15]; Pcsk9 是一種促炎因子, 其基因缺失小鼠可有效降低炎性反應(yīng)相關(guān)因子表達(dá)[16]; Cd5l、 Fcn2、Xpnpep2、 Ganab 等在骨關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液或關(guān)節(jié)軟骨中表達(dá)量顯著上調(diào)[17-20];DKK3 缺失可抑制NF-κB 信號通路, 進(jìn)而降低炎性反應(yīng)癥狀[21]; Nfkbiz 為非典型IκB 蛋白家族成員,也為各種炎癥刺激誘導(dǎo)下NF-κB 的主要反應(yīng)因子,既是促炎因子, 又是抗炎基因產(chǎn)物活性的調(diào)控因子[22]; Zfhx2、 Prkcsh、 Napsa 等在炎性反應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮重要作用[23]。 由此表明, 圣科健骨膠囊可通過抑制相關(guān)炎性因子表達(dá)來對骨關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎實現(xiàn)防治作用。

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