桉樹種植對(duì)林地土壤叢枝菌根真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響

李佳雨,林家怡,裴晨羽,黃 林,黃銳洲,唐光大

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院/中國南方石灰?guī)r植物研究中心, 廣州 510640

桉樹是桃金娘科(Myrtaceae)桉屬植物的總稱。由于其環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、生長迅速、輪伐期短、產(chǎn)量高,具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,已被廣泛引種栽培[1- 2]。目前,全世界約5000萬hm2的熱帶人工林中,桉樹的種植面積占了40%[3- 4]。中國是世界上第二大桉樹生產(chǎn)國,截至2016年,種植面積已經(jīng)達(dá)到368萬hm2,預(yù)計(jì)仍將以每年20萬hm2的速度增長[5]。在產(chǎn)生巨大經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí),桉樹種植帶來的林下生物多樣性降低、生物棲息地減少等生態(tài)問題也不容忽視[6- 8]：一方面,桉樹根系和凋落物產(chǎn)生的化感物質(zhì)直接或間接影響了土著植物的生長及光合作用等[9- 13]；另一方面,桉樹耗水耗肥量大,而大量的人工施肥改變了原生土壤的養(yǎng)分循環(huán)節(jié)奏,長期種植可能引起土壤質(zhì)量變化。而在土壤質(zhì)量變化過程中,理化特征和生物學(xué)性質(zhì)等均會(huì)產(chǎn)生敏感響應(yīng)。已有的研究結(jié)果顯示,桉樹的連續(xù)種植會(huì)導(dǎo)致土壤有機(jī)碳和全氮含量降低,同時(shí)降低土壤微生物的生物量碳和氮含量[14- 15]；而隨著種植年份的增加,土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生顯著變化[16- 18]。

AM真菌隸屬于球囊菌門,普遍存在于土壤環(huán)境中,能夠與80%以上的陸生植物形成共生體系[19],在利用植物提供的有機(jī)養(yǎng)分的同時(shí),促進(jìn)宿主植物對(duì)氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,提高植物抗逆抗病能力[20- 21],承擔(dān)著養(yǎng)分運(yùn)輸、能量流動(dòng)和信息傳遞等生態(tài)功能,對(duì)生物多樣性的維持和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定具有重要作用。同時(shí),AM真菌可以減輕入侵植物對(duì)本土植物的消極影響,抑制入侵植物的化感作用,以維持入侵地的生態(tài)平衡[22- 23]。AM真菌群落結(jié)構(gòu)也會(huì)受土壤類型、海拔高度、坡向、水分狀況和肥力等的影響[24- 25],植被類型和土壤理化性質(zhì)的改變會(huì)造成AM真菌群落發(fā)生變化。例如,長期種植毛竹(Phyllostachysedulis(Car.) J. Houz.)會(huì)使 AM真菌生物量顯著降低,群落結(jié)構(gòu)明顯改變,不利于土壤碳固存和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定[26]；在人工種植柚木(TectonagrandisLinn.)的林地土壤中,也發(fā)現(xiàn)真菌孢子密度發(fā)生了顯著變化[27]。而對(duì)于桉樹人工林中AM真菌群落的變化特征,尚缺乏足夠的了解。

開展桉樹種植對(duì)林地土壤AM真菌影響的相關(guān)研究,探討大面積人工純林種植對(duì)土壤微生物環(huán)境的長期影響,對(duì)森林經(jīng)營和植被恢復(fù)等具有較強(qiáng)的指導(dǎo)意義。本研究比較了次生林改種桉樹后,不同種植年份的桉樹林中土壤AM真菌種類、群落組成及多樣性的變化,試圖厘清桉樹林土壤中AM真菌群落隨種植年限的變化趨勢(shì),以期為桉樹林的栽培管理和環(huán)境修復(fù)等提供理論依據(jù)。

1 研究樣地概況

研究樣地位于廣東省惠州市惠陽區(qū)鎮(zhèn)隆鎮(zhèn)(22°57′N,114°21′E),屬于亞熱帶季風(fēng)性氣候,年平均降雨量約2000 mm,集中在4月至9月,年平均溫度為22℃,降雨量充足,光照豐富。試驗(yàn)地選取皆伐種植的桉樹林,并以鄰近的次生林作為對(duì)照。桉樹林下最常見的植物有鹽膚木(RhuschinensisMill.),光葉山黃麻(TremacannabinaLour.),山麻桿(Alchorneatrewioides(Benth.) Muell. Arg.),春花(Rhaphiolepisindica(L.) Lindl. ex Ker),展毛野牡丹(MelastomanormaleD. Don),芒草(MiscanthussinensisAnderss.),山菅蘭(Dianellaensifolia(L.) DC.),異葉鱗始蕨(LindsaeaheterophyllaDry.)等；次生林中常見植物有馬尾松(PinusmassonianaLamb.),鼠刺(IteachinensisHook. et Arn.),鴨腳木(Scheffleraheptaphylla(Linn.) Frod.),山烏桕(Sapiumdiscolor(Champ. ex Benth.)Muell.-Arg.),黑面神(Breyniafruticosa(Linn.) Müll. Arg.),桃金娘(Rhodomyrtustomentosa(Ait.) Hass.),梅葉冬青(Ilexasprella(Hook. et Arn.) Champ. ex Benth),春花,芒草,異葉鱗始蕨,芒萁(Dicranopterispedata(Hout.) Nakai.),鬼燈籠(ClerodendrumfortunatumLinn.),烏毛蕨(BlechnumorientaleLinn.)等。

2 試驗(yàn)方法和材料

樣本采集于2017年3月,在3個(gè)相鄰但種植年份不同的桉樹林(2年生、5年生和10年生)中進(jìn)行,同時(shí)在鄰近的次生林樣地采集對(duì)照樣本。按照“S”型曲線在坡向相同、海拔相近(110—120 m)處設(shè)置10 m×10 m樣方,每個(gè)樣地設(shè)3個(gè)樣方,參照Qin等和Carrillo-Saucedo等的方法[28-29],樣方內(nèi)以“5點(diǎn)取樣法”采集表層土壤(0—15 cm)共計(jì)1 kg左右；同時(shí)在不傷及植物根系結(jié)構(gòu)的前提下,在樣方內(nèi)采集桉樹根樣,放入FAA(Formalin-acetic acid-alcohol)固定液中。將同一樣方內(nèi)的土壤樣品混合均勻,并剔除植物殘?bào)w及石礫,放入無菌封口袋,置于冰盒中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。土壤樣品過4 mm篩后分成2份,保存于4℃冰箱：1份用于土壤理化性質(zhì)的測定,另1份用于土壤AM真菌孢子的分離和鑒定。

2.1 土壤理化性質(zhì)分析

2.2 AM真菌孢子鑒定與侵染率測定

采用濕篩傾析-蔗糖離心法[31]分離土壤AM真菌孢子,壓片,根據(jù)其形態(tài)特征,參考國際VA菌根網(wǎng)站(https://invam.wvu.edu/home)的鑒定圖片,形態(tài)描述及最新分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行種屬的檢索和鑒定。

菌根侵染率測定步驟如下：將采集的根樣從FAA固定液中取出,剪成約1 cm長的根段,置于裝有10% KOH溶液的玻璃瓶中,放在90℃水浴鍋中消解至透明(根系產(chǎn)生明顯氣泡)；取出根樣,放入錐蟲藍(lán)乳酸甘油溶液(錐蟲藍(lán)0.24 g；乳酸10 mL；甘油160 mL；蒸餾水160 mL)中,染色15—60 min,將根段整齊擺放在載玻片上,蓋片后鏡檢。菌根侵染率的計(jì)算采用根段頻率常規(guī)法[32],在Leica光學(xué)顯微鏡下觀察每條根段的侵染情況,根據(jù)侵染點(diǎn)、菌絲、叢枝和泡囊等菌根結(jié)構(gòu)所占比例,分為0—5共6個(gè)等級(jí),然后根據(jù)叢枝和泡囊在菌根結(jié)構(gòu)中的有無及豐富度,將1—5級(jí)劃分為A0,A1,A2,A3共4個(gè)級(jí)別。統(tǒng)計(jì)不同桉樹種植年份中AM真菌菌根侵染情況,每個(gè)年份隨機(jī)選取30條根段進(jìn)行鏡檢計(jì)數(shù),最后將數(shù)據(jù)輸入MYCOCALC軟件計(jì)算菌根侵染率。

2.3 數(shù)據(jù)分析

2.3.1AM真菌群落結(jié)構(gòu)特征指標(biāo)：

(1)AM真菌孢子密度和種豐度

孢子密度：指每100 g干土中孢子或孢子果的數(shù)量,其中1個(gè)孢子果按照1個(gè)孢子計(jì)數(shù)。

種豐度[33]：物種豐富度,以每個(gè)土壤樣本中AM真菌的物種數(shù)目表征。

(2)物種多樣性指數(shù)和均勻度

本文采用香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)和均勻度表示物種多樣性及分布情況。

香農(nóng)指數(shù)(H)=-∑(PilnPi)

辛普森指數(shù)(D)=1-∑(Pi)2

均勻度指數(shù)(J)=H/lnS

式中,Pi表示土樣中種i的AM真菌孢子數(shù)ni與孢子總數(shù)N的比值；S為土樣中AM真菌種的數(shù)目。

2.3.2統(tǒng)計(jì)分析

采用“Microsoft Excel 2017”軟件對(duì)土壤理化性質(zhì)、孢子密度、種豐度、物種相對(duì)豐度和多樣性指數(shù)等數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入及初步分析；采用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析(不同組間土壤性質(zhì)和AM真菌豐度差異等)；采用非度量多維尺度法(Nonmetric Multi-Dimensional Scaling,NMDS)對(duì)Bray-Curtis距離進(jìn)行降維分析以解析群落結(jié)構(gòu)；進(jìn)一步通過冗余分析(Redundancy Analysis, RDA)解析不同環(huán)境因子對(duì)于AM真菌群落結(jié)構(gòu)的影響,并通過999次蒙特卡洛置換來檢驗(yàn)因子的顯著性。Bray-Curtis距離計(jì)算、矩陣降維及RDA均在R 3.3.3中使用 “vegan”包計(jì)算[34]。

3 結(jié)果與分析

3.1 桉樹種植對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

表1 不同桉樹種植年份土壤理化性質(zhì)

同一列不同字母代表組間差異顯著(P<0.05)

3.2 桉樹種植對(duì)土壤AM真菌群落的影響

3.2.1AM真菌種類變化

從所有的檢測樣本中鑒定出AM真菌共9屬18種,其中無梗囊霉屬Acaulospora6種,斗管囊霉屬Funneliforms4種,球囊霉屬Glomus1種,原囊霉屬Archaeospora1種,和平囊霉屬Pacispora1種,近明球囊霉屬Claroideoglomus1種,盾巨孢囊霉屬Scutellospora1種,根孢囊霉屬Rhizophagus2種,隔球囊霉屬Septoglomus1種(表2)。次生林土壤中的AM真菌種類最多(15種),2年生、5年生和10年生桉樹林土壤中分別分離出11種、9種和13種AM真菌,均少于次生林真菌種類。其中,A.bireticulata、Acaulosporasp1、F.mosseae、F.geosporus、F.verruculosus、Funneliformssp1和Glomussp1在次生林和所有桉樹林土壤中均有發(fā)現(xiàn),Pacisporasp1和Scutellosporasp1只在次生林中存在。另外,A.spinosa、Archaeosporasp1、Claroideoglomussp1和Rhizophagussp2在5年生桉樹林中未發(fā)現(xiàn),卻在2年生、10年生桉樹林和次生林中存在。A.capsicula和S.deserticola只在桉樹林中存在,在次生林中未發(fā)現(xiàn)。

3.2.2AM真菌孢子密度和種豐度變化

在2年生、5年生、10年生桉樹林及次生林土壤中,每100 g干土中孢子個(gè)數(shù)分別為2520個(gè)、1553個(gè)、2953個(gè)和6233個(gè)。整體而言,桉樹林土壤中的真菌孢子密度顯著低于次生林,在2年生桉樹林土壤中明顯下降,5年生土壤中降到最低,但在10年生桉樹林土壤中得到一定程度恢復(fù)(圖1)。AM真菌種豐度變化與之類似,桉樹林的土壤AM真菌種豐度明顯低于次生林(11.33),隨種植年份的增加逐漸下降,在10年生桉樹林土壤中亦有所恢復(fù)(圖2)。

表2 不同桉樹種植年份土壤AM真菌群落組成變化

“+”表示有,“-”表示無

圖1 不同桉樹種植年份土壤AM真菌孢子密度 Fig.1 Spore density of soil AM fungi in differentEucalyptusplanting years

圖2 不同桉樹種植年份土壤AM真菌種豐度 Fig.2 Species richness of soil AM fungi in differentEucalyptusplanting years

3.2.3不同種植年限的桉樹林土壤中AM真菌菌根侵染變化

5年生桉樹根系的AM菌根侵染率最高,其次是2年生,而10年生的根系菌根侵染率最低；叢枝豐富度方面,5年生桉樹根系的豐富度最高,其次是10年生、2年生(表3)。

3.2.4AM真菌孢子多樣性和均勻度

土壤中AM真菌在桉樹種植2年時(shí)香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)分別最高,而種植5年時(shí)均為最低,但單因素方差分析比較結(jié)果顯示：組間多樣性指數(shù)差異不顯著(P<0.05)。桉樹種植2年的土壤中AM真菌均勻度最高,顯著高于5年生及次生林土壤,但與10年生的土壤相比差異不顯著(表4)。

表3 不同桉樹種植年份根系侵染率(%)

表4 不同桉樹種植年份土壤AM真菌孢子多樣性和均勻度

3.2.5AM真菌群落結(jié)構(gòu)

圖3 不同桉樹種植年份土壤AM真菌非度量多維尺度分析 Fig.3 Nonmetric Multi-Dimensional Scaling (NMDS) of AM fungi in differentEucalyptusplanting years

非度量多維尺度分析(NMDS)結(jié)果顯示,桉樹林與次生林的AM真菌群落組成存在明顯差異,相互距離較遠(yuǎn),尤其是2年生和5年生桉樹林的樣本,差異最大；在不同種植年份中,AM真菌群落組成不同,在圖中分布在不同的位置(圖3)。

根據(jù)不同組間孢子相對(duì)豐度的計(jì)算和單因素方差分析,次生林、5年生和10年生桉樹林土壤中優(yōu)勢(shì)種為Funneliformsgeosporus,但在2年生土壤中顯著降低；而2年生的優(yōu)勢(shì)種為Septoglomusdeserticola,平均相對(duì)豐度為36.28%,顯著高于5年生和次生林；Archaeosporasp1在次生林土壤中占比相對(duì)較高,為8.65%,顯著高于其他桉樹林土壤；Funneliformsmosseae在2年生桉樹林土壤中占比相對(duì)較高,為10.64%,顯著高于其他年份的桉樹林和次生林土壤；F.verruculosus在2年生和10年生土壤中顯著高于次生林；Acaulosporabireticulata的相對(duì)豐度在10年生土壤中有顯著增長,達(dá)到4.7%；Acaulosporasp2在桉樹種植2年生土壤中未發(fā)現(xiàn),但在5年生和10年生土壤中有所恢復(fù),且與次生林接近(圖4)。另外,Pacisporasp1和Scutellosporasp1僅在次生林土壤樣本中出現(xiàn),且豐度較低,在不同年份之間無明顯組間差異。

圖4 不同桉樹種植年份土壤AM真菌相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of soil AM fungi in differentEucalyptusplanting years

圖5 不同桉樹種植年份土壤AM真菌與土壤理化因子冗余分析Fig.5 Redundancy Analysis (RDA) between AM fungi community and soil properties in differentEucalyptusplanting years

3.3 環(huán)境因子對(duì)桉樹林土壤中AM真菌群落的影響

土壤AM真菌群落與土壤環(huán)境因子的冗余分析(RDA)結(jié)果顯示(圖5),土壤pH、SOC、TN、TK是影響土壤AM真菌群落的主要因子,RDA1解釋率為82.3%,表明土壤理化性質(zhì)是影響土壤中AM真菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素,在次生林中與pH、SOC、TN、TK呈正相關(guān)關(guān)系；RDA2的解釋率僅為4.36%,主要影響因子為TK。根據(jù)蒙特卡洛置換試驗(yàn)結(jié)果,pH、TN、SOC和TK作為具有顯著影響的環(huán)境因子,在第一軸上的解釋率分別為89.88%,57.72%,34.69%和33.2%,表明pH值是土壤中AM真菌群落的主要影響因子。

4 討論

在陸地生態(tài)系統(tǒng)中,土壤微生物能夠影響植被生長、群落組成和多樣性,同時(shí)陸地植被的改變也會(huì)影響土壤中微生物生態(tài)系統(tǒng),兩者形成動(dòng)態(tài)相互作用的關(guān)系。植物通過根系分泌物、凋落物的淋溶、分解、釋放化合物質(zhì)等,直接或間接改變土壤微生物的組成和結(jié)構(gòu)[35]。桉樹作為外來樹種被廣泛引種種植,將物種多樣性較高的原生植被替代為桉樹純林,其自身生理代謝和人為管理措施(施肥、灌溉等)都可能使土壤理化性質(zhì)發(fā)生改變,如SOC降低[14,36-37]。本研究結(jié)果顯示,2年生和10年生桉樹林中,土壤SOC顯著降低,可能是因?yàn)殍駱浞N植對(duì)土壤團(tuán)聚體產(chǎn)生了影響,從而引起土壤中SOC的降低[38]；5年生桉樹林土壤SOC顯著高于2年和10年桉樹林,這可能是第5年桉樹凋落物積累較多,而土壤微生物分解率低所造成的結(jié)果[39],而凋落物淋溶產(chǎn)生的化感物質(zhì)形成了不利于AM真菌孢子生長和繁殖的環(huán)境,導(dǎo)致孢子密度和種豐度顯著降低；有研究表明土壤SOC與AM真菌侵染狀況呈顯著正相關(guān)[40],這可能是5年生土壤中AM真菌侵染率較高的原因之一。其他土壤營養(yǎng)元素,如TP、AP等在桉樹林中的增加和降低也可能與凋落物的分解、淋溶、礦化等有關(guān)[41-42]。

當(dāng)宿主植被群落發(fā)生改變時(shí),土壤中AM真菌的種類和結(jié)構(gòu)可能會(huì)隨之改變；而當(dāng)土壤中AM真菌群落改變后,地表植物的種類和數(shù)量可能也會(huì)改變,植物群落結(jié)構(gòu)和多樣性也隨之改變[43]。本研究結(jié)果證實(shí)了桉樹種植使土壤中的AM真菌孢子密度和種豐度顯著降低,真菌群落發(fā)生了顯著改變。然而,AM真菌種類和群落改變后,是否引起桉樹林下植被和多樣性發(fā)生改變,尚需進(jìn)一步開展相關(guān)研究。林地土壤中,P含量是影響AM真菌孢子密度的因素之一,與孢子密度呈負(fù)相關(guān)[44],本研究發(fā)現(xiàn)TP和AP含量高的桉樹林土壤中,孢子密度相對(duì)較低,故土壤營養(yǎng)元素的變化,也會(huì)影響AM真菌的種類和多樣性。

從AM真菌屬種水平分析結(jié)果來看,Acaulospora屬和Funneliforms屬在種植前后均為土壤中AM真菌的優(yōu)勢(shì)屬,這與其他陸地生態(tài)系統(tǒng)中土壤優(yōu)勢(shì)屬相吻合[45-47],說明桉樹的種植對(duì)土壤中AM真菌優(yōu)勢(shì)屬的影響較小。然而,F.geosporus作為次生林中的優(yōu)勢(shì)種,在種植桉樹后相對(duì)豐度顯著降低,冗余分析結(jié)果顯示pH值對(duì)土壤AM真菌群落影響較大,可能桉樹種植后,土壤酸化對(duì)F.geosporus繁殖和生長產(chǎn)生了抑制。Pacisporasp1和Scutellosporasp1在次生林中存在,而在桉樹種植后消失,可能與土壤理化因子的變化有關(guān)。A.capsicula和S.deserticola是桉樹林土壤中分離到,但未在次生林中發(fā)現(xiàn)的種類,可能這兩種AM真菌對(duì)桉樹林土壤環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。桉樹的種植對(duì)AM真菌多樣性指標(biāo)影響較小,可能是土壤中AM真菌物種的增加或減少在植被改變后得到了及時(shí)補(bǔ)償,有些真菌減少或消失,但有些真菌又新增。

土壤pH作為衡量土壤狀況的一個(gè)重要指標(biāo)受地面植被類型影響較大,桉樹的種植容易導(dǎo)致土壤pH值降低[48-49]。本研究結(jié)果表明,2年生和10年桉樹林土壤pH值顯著降低,可能桉樹種植加快了土壤中酸性離子的積累[50]。AM真菌孢子密度與土壤pH值呈負(fù)相關(guān)[51],因此5年生桉樹林土壤AM真菌孢子密度和種豐度較低可能與土壤pH升高有關(guān)。另外,酸性的土壤環(huán)境更適應(yīng)AM真菌中Acaulospora屬的生長[52],這可能是桉樹林在2年生和10年生時(shí)Acaulospora屬孢子的相對(duì)豐度均高于次生林和5年生的原因之一。

本研究采用濕篩傾析法分離土壤AM真菌孢子,土壤清洗過程中部分孢子可能會(huì)丟失,結(jié)果有一定的誤差,但鑒定依據(jù)較為充分,調(diào)查結(jié)果可反映AM真菌群落狀況,與高通量測序法相比,鑒定更加準(zhǔn)確,并能獲得孢子密度等統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。后期研究中,建議濕篩傾析法與高通量測序方法相結(jié)合,充分探討森林植被改變后土壤真菌群落和多樣性的相關(guān)變化。森林土壤生態(tài)系統(tǒng)中,AM真菌與植物根系形成非常復(fù)雜的地下生態(tài)網(wǎng)絡(luò),森林植被的改變,土壤真菌系統(tǒng)也可能發(fā)生變化,相關(guān)機(jī)制有待深入研究。