低溫脅迫下6種木蘭科植物的生理響應(yīng)及抗寒相關(guān)基因差異表達(dá)

李瑞雪,金曉玲,胡希軍,汪結(jié)明,羅 峰,張方靜

1 中南林業(yè)科技大學(xué),長(zhǎng)沙 410004 2 湖南科技大學(xué),湘潭 411201 3 中南林業(yè)科技大學(xué)湖南省環(huán)境資源植物開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心,長(zhǎng)沙 410004

木蘭科(Magnoliaceae)植物花色艷麗,花香襲人, 樹姿優(yōu)美,是珍貴的園林綠化樹種。木蘭科植物喜溫暖濕潤(rùn)的氣候,耐寒性較差,主要集中分布于我國(guó)東南至西南部,向東北及西北地區(qū)逐漸減少,其“抗寒不常綠,常綠不抗寒”的特點(diǎn)極大地限制了這一珍貴的樹種在我國(guó)北方城市中的應(yīng)用,北方高寒地區(qū)引種的木蘭科樹種常遭受到嚴(yán)重凍害[1- 3]。因此,篩選抗寒性強(qiáng)的常綠木蘭科樹種,研究低溫條件下其耐寒生理和分子機(jī)制,對(duì)提高木蘭科植物的耐寒適應(yīng)性,并將該物種向高寒地區(qū)成功引種栽培,豐富改善我國(guó)北方城市冬季蕭條的園林景觀,推進(jìn)城市園林建設(shè)具有重要意義。

低溫限制植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和地理分布,對(duì)植物的影響顯著大于其他環(huán)境脅迫因素[4- 6]。低溫脅迫不但影響植物生物量、葉、莖等形態(tài)指標(biāo)的變化,而且引起植物新陳代謝紊亂,嚴(yán)重低溫脅迫下甚至導(dǎo)致植株死亡[7- 9]。研究表明,植物感受到低溫信號(hào)后,啟動(dòng)防御機(jī)制,細(xì)胞膜透性增加,活性氧產(chǎn)生,保護(hù)酶活性增強(qiáng),滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如可溶性蛋白(SP)、可溶性糖(SS)和游離脯氨酸(Pro)[10- 11]和膜脂相變及膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量積累[12- 14],而與代謝相關(guān)的生化途徑會(huì)被抑制[15- 16]。在植物抗寒性研究中,低溫半致死溫度(LT50)及相關(guān)生理指標(biāo)常被作為評(píng)價(jià)植物抗寒性的重要參考指標(biāo)[17- 20]。植物的抗寒性是由多因素聯(lián)合控制的綜合性數(shù)量性狀,而僅依據(jù)單一的生理指標(biāo)難以準(zhǔn)確全面地反映出植物抗寒性的強(qiáng)弱,對(duì)植物抗寒性的評(píng)價(jià)應(yīng)選取若干具有代表性的生理生化指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[21]。隸屬函數(shù)法作為抗性綜合評(píng)價(jià)的科學(xué)方法,能比較準(zhǔn)確地篩選出與抗寒性密切相關(guān)的典型指標(biāo),反映植物之間抗寒性的差異,該方法已應(yīng)用于柑橘(Citrusreticulata)[22]、冬青(lexchinensis)[23]、黃梁木(Neolamarckiacadamba)[24]、苔草 (Carextristachya)[25]、小麥(Triticumaestivum)[26]、苜蓿草(Lotuscorniculatus)[27]等植物的抗寒性研究中,但在木蘭科植物中卻鮮見報(bào)道。低溫環(huán)境下植物的生理生化機(jī)能受多種基因的相互調(diào)節(jié)而發(fā)生變化,并進(jìn)一步誘導(dǎo)特定基因的表達(dá)以抵御逆境[28- 29]。第二代高通量測(cè)序技術(shù)能夠?qū)Υ笠?guī)模轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行快速鑒定和功能分析,檢測(cè)基因的表達(dá)差異,較全面地揭示逆境脅迫下整個(gè)基因組水平的表達(dá)情況,作為研究植物基因功能的重要手段,已經(jīng)在低溫響應(yīng)機(jī)制、關(guān)鍵基因挖掘等方面取得了較大進(jìn)展,被廣泛應(yīng)用于擬南芥(Arabidopsisthaliana)[30]、小麥[31- 32]、桉樹(Eucalyptusrobusta)[33]、橄欖樹(Oleaeuropaea)[34]等植物冷適應(yīng)和低溫響應(yīng)機(jī)制的研究中。目前已發(fā)現(xiàn)數(shù)百個(gè)基因參與到植物對(duì)冷脅迫的應(yīng)答反應(yīng)[35],XU等[36]通過對(duì)野生山葡萄(Vitisamurensis)應(yīng)對(duì)冷脅迫的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)野生山葡萄是通過控制一些基因的差異表達(dá)來響應(yīng)冷脅迫。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)木蘭科植物的研究多集中在雜交育種及無性系繁植方面[37- 40],對(duì)其抗寒性的研究非常匱乏,偶見抗寒生理指標(biāo)的比較分析[41- 43],從分子水平上對(duì)木蘭科植物抗寒機(jī)制的研究更是鮮見報(bào)道,僅見鵝掌楸(Liriodendronchinense)的相關(guān)報(bào)道[44]。

為解析木蘭科植物的抗寒機(jī)制,本研究選用樂東擬單性木蘭(Parakmerialotungensis)、六瓣含笑(Micheliamartinii‘Tiny’)、闊瓣含笑(M.platypetala)、峨眉含笑(M.wilsonii)、雜交含笑(M.martinii‘Tiny’♀×M.shiluensis♂)、紅花深山含笑(M.maudiaevar. rubicunda) 為材料,測(cè)定其在不同低溫下的相對(duì)電導(dǎo)率(REC),擬合Logistic方程計(jì)算各樹種的低溫半致死溫度(LT50),依據(jù)各相關(guān)生理指標(biāo)的差異,將其與LT50進(jìn)行相關(guān)性分析, 運(yùn)用隸屬函數(shù)法計(jì)算相關(guān)生理指標(biāo)的隸屬函數(shù)值,按平均隸屬度大小對(duì)6種木蘭科植物進(jìn)行抗寒性排序,建立科學(xué)的木蘭科植物抗寒性評(píng)價(jià)體系。本課題組前期研究中從樂東擬單性木蘭無性系抗寒轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中發(fā)現(xiàn)2個(gè)抗寒相關(guān)調(diào)控基因HSP90熱激蛋白基因(GenBank登陸號(hào)MG932087)和WRKY33轉(zhuǎn)錄因子(GenBank登陸號(hào)MG932087)在響應(yīng)低溫脅迫過程中顯著上調(diào)或下調(diào)表達(dá)。另外其他研究亦表明,HSP熱激蛋白和WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因在植物響應(yīng)非生物脅迫中具有重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能[45- 47]。為進(jìn)一步分析低溫脅迫過程中這2個(gè)抗寒差異基因在6種木蘭科植物中的表達(dá)規(guī)律, 以HSP90和WRKY33基因的 EST保守序列設(shè)計(jì)特異引物,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative Real-Time PCR,qPCR)技術(shù)分析了HSP90和WRKY33基因在6個(gè)木蘭科樹種之間的表達(dá)差異,為揭示木蘭科植物的抗寒機(jī)理和抗寒品種選育提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

以樂東擬單性木蘭、六瓣含笑、闊瓣含笑、峨眉含笑、雜交含笑和紅花深山含笑6種木蘭科植物的無性系盆栽苗為供試材料。2016年12月3日分別選取各樹種生長(zhǎng)良好,長(zhǎng)勢(shì)一致的扦插栽苗各54株移栽到花盆并置于溫室(溫度：25℃,濕度65%：光強(qiáng)：200 uEm;光周期：14 h光照/10 h黑暗)中培養(yǎng)2周。試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)處理,每個(gè)處理3株,3次重復(fù)。以0℃處理為對(duì)照,分別在人工低溫氣候箱進(jìn)行0℃、-5℃,-10℃、-15℃、-20℃和-25℃低溫下脅迫2 h,從各樹種各處理植株選取當(dāng)年生側(cè)枝的成熟葉片,用于電導(dǎo)率和各相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定。同時(shí)迅速取各植株頂端幼嫩葉片裝入到離心管中立即投入到液氮中速凍,以并置于-80℃冰箱中保存,用于RNA 的提取和qPCR試驗(yàn)。以上試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1電導(dǎo)率及生理生化指標(biāo)的測(cè)定

參照朱海根[48]的電導(dǎo)法在DDS- 310 型電導(dǎo)儀上測(cè)定葉片相對(duì)電導(dǎo)率。參照陳建勛[49]的方法測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)。丙二醛(MDA) 含量采用硫代巴比妥酸(TBA)顯色法測(cè)定,游離脯氨酸(Pro)含量采用酸性茚三酮法測(cè)定,超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT光還原法測(cè)定,愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物歧化酶(POD)活性,考馬斯亮藍(lán)G- 250法測(cè)定可溶性蛋白(SP)含量,可溶性糖(SS)含量用蒽酮比色法測(cè)定。

1.2.2總RNA提取與cDNA合成

采用Trizol試劑盒(上海閃晶分子生物科技有限公司)提取各植株葉片的總RNA,參照試劑盒說明進(jìn)行提取。利用1%瓊脂糖電泳、QubitFluorometer檢測(cè)樣品RNA濃度,NanoDrop 2000檢測(cè)樣品RNA純度,Agilent 2100檢測(cè)樣品RNA完整性及RIN值。采用qPCR逆轉(zhuǎn)錄專用試劑盒PrimeScript TMRT reagent Kit (Perfect Real Time)(大連TaKaRa公司)合成 cDNA,具體方法詳見試劑盒說明書。

1.2.3qPCR 候選基因與引物設(shè)計(jì)

用于qPCR分析的2個(gè)差異表達(dá)基因及特異引物見(表1)。選擇Beta Actin(β-Actin)作為內(nèi)參基因。特異引物的設(shè)計(jì)使用Primer premier 6.0 軟件。qPCR分析在Strata gene MX3000p(上海智巖科學(xué)儀器有限公司)上進(jìn)行,每個(gè)樣品3次重復(fù),采用 EvaGreen2x qPCR MasterMix-Low ROX(abm,Canada)試劑盒進(jìn)行qPCR檢測(cè),方法參照試劑盒的操作說明。具體為,熱循環(huán)反應(yīng)條件為95℃預(yù)熱10 min,然后95℃15 s、55℃30 s及72℃30 s循環(huán)40次,在每個(gè)周期結(jié)束時(shí)測(cè)量熒光。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后利用熔解曲線檢測(cè)產(chǎn)物特異性: 將該反應(yīng)體系從60℃ 緩慢升溫至97℃,每升高1℃采集5次熒光信號(hào)。

表1 候選抗寒基因及qPCR引物

R2表示標(biāo)準(zhǔn)曲線cDNA 模板濃度與CT 值的相關(guān)系數(shù)

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

參照張文娥[50]的方法計(jì)算抗寒隸屬函數(shù)值。如植物的葉片生理指標(biāo)與抗寒性呈正相關(guān),則將其隸屬值累加,取平均數(shù)以評(píng)定其抗寒性,公式如下：

R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

如指標(biāo)與抗寒力呈負(fù)相關(guān),則用反隸屬函數(shù)計(jì)算,公式如下：

R(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中,R為隸屬函數(shù)值；Xi為某項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定值；Xmin、Xmax為所有參試材料中該項(xiàng)指標(biāo)的最小值和最大值。

參照許瑛等[51]的方法,根據(jù)電導(dǎo)率擬合Logistic方程:y=K/(1+ae-bx),其中y代表不同低溫處理下的相對(duì)電導(dǎo)率,K代表電導(dǎo)率的飽和值(最大值為100),x表示脅迫處理溫度,a、b代表回歸系數(shù),將方程進(jìn)行線性化處理求出a、b的值,計(jì)算半致死溫度(LT 50): LT 50 =lna/b。

參照李楠[52]采用2-ΔΔC T法計(jì)算 qPCR 試驗(yàn)中的基因相對(duì)表達(dá)量,計(jì)算公式為:基因相對(duì)表達(dá)量= 2-ΔΔCT。其中,ΔΔCT計(jì)算公式為: ΔΔCT=ΔCT (試驗(yàn)組)-ΔCT(對(duì)照組); 試驗(yàn)組或?qū)φ战M的ΔCT計(jì)算公式為:ΔCT=CT(目的基因)-CT(內(nèi)參基因)。利用Excel 2016、 Originpro 2017、SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下葉片的相對(duì)電導(dǎo)率變化和半致死溫度

圖1 不同低溫下6種木蘭科植物的相對(duì)電導(dǎo)率變化 Fig.1 Changes in relative electric conductivity of six varieties of Magnoliaceae under different low temperatures

由圖1可知,隨處理溫度的下降,6個(gè)樹種的相對(duì)電導(dǎo)率(REC)基本呈逐漸升高的趨勢(shì),當(dāng)溫度高于低溫半致死溫度(LT50)REC升高緩慢,低于LT50后REC則迅速升高。這說明隨溫度的降低,各樹種葉片細(xì)胞膜受損愈加嚴(yán)重,膜透性也逐漸增大。整個(gè)低溫過程中,紅花深山含笑的REC都顯著高于其余5個(gè)樹種(P<0.05)。在0—-10℃,除了紅花深山含笑外,其余5個(gè)樹種的相對(duì)電導(dǎo)率差異不顯著(P>0.05)。當(dāng)溫度低于-10℃時(shí),紅花深山含笑的REC開始迅速升高,-15℃時(shí),闊瓣含笑、雜交含笑和峨眉含笑REC也迅速升高且處理間差異不顯著(P>0.05),樂東擬單性木蘭和六瓣含笑在-20℃后REC才開始迅速升高,這表明LT50出現(xiàn)越晚的樹種越能抵御低溫的傷害。

如表2所示,6個(gè)樹種的相對(duì)電導(dǎo)率的R2均在0.9以上,說明各樹種的REC與0—-25℃低溫處理2 h的LT50之間呈極顯著正相關(guān)。6種木蘭科植物的LT50在-22.06—-10.64℃,其中樂東擬單性木蘭和六瓣含笑的LT50低于-20℃,峨眉含笑、雜交含笑和闊瓣含笑的在-20—-15℃,而紅花深山含笑的LT50為-10.64℃。6種木蘭科植物的LT50從低到高的順序?yàn)椋簶窎|擬單性木蘭<六瓣含笑<闊瓣含笑<雜交含笑<峨眉含笑<紅花深山含笑。

表2 6種木蘭科植物相對(duì)電導(dǎo)率的Logistics方程及低溫半致死溫度(LT50)

Table 2 Logistics equation of the relative electric conductivity and the median lethal temperature(LT50)of six varieties of Magnoliaceae under different low temperatures

品種VarietyLogistics方程Logistics equation半致死溫度/℃ Median lethal temperature R2樂東擬單性木蘭P. lotungensisy=100/(1+3.69e-0.059x)-22.06 0.930六瓣含笑M. martinii‘Tiny’ y=100/(1+6.237e-0.091x)-20.120.919闊瓣含笑M. wilsonii y=100/(1+6.01e-0.102x)-17.510.942雜交含笑M. platypetalay=100(1+3.829e-0.079x)-16.790.962峨眉含笑M. martinii‘Tiny’ ♀×M. shiluensis ♂y=100/(1+7.44e-0.120x)-16.680.937紅花深山含笑M. maudiae var. rubicunday=100/(1+2.80e-0.097x)-10.640.968

R2為相關(guān)性大小,0.7—0.9表示相關(guān)性顯著,0.9以上表示相關(guān)性極顯著

2.2 對(duì)可溶性蛋白含量的影響

如圖2所示,在0℃低溫處理下,6種木蘭科植物葉片可溶性蛋白(SP)含量除了紅花深山含笑外,其余5個(gè)樹種間差異不顯著且隨溫度的降低呈先升后降的單峰變化。樂東擬單性木蘭和六瓣含笑的峰值在-20℃,闊瓣含笑、雜交含笑、峨眉含笑的峰值均在-15℃,而紅花深山含笑至-10℃達(dá)到峰值,峰值時(shí),SP含量和增幅從高到低依次為樂東擬單性木蘭>六瓣含笑>闊瓣含笑>峨眉含笑>雜交含笑>紅花深山含笑,分別比0℃時(shí)增加了的123.66%、96.65%、96.43%、73.97%、52.74%和46.85%。可見,LT50越低的樹種其峰值出現(xiàn)得越晚,SP含量增幅越高。峰值之后,LT50越低的樹種可溶性蛋白含量下降幅度越大,到了-25℃,可溶性蛋白含量較其峰值時(shí)下降幅度最大的是樂東擬單性木蘭,下降了3.43 μg/g,其次為六瓣含笑,下降了2.97 μg/g,下降幅度最小的是紅花深山含笑,僅下降了1.69 μg/g。

2.3 對(duì)可溶性糖含量的影響

如圖3所示,6種木蘭科植物葉片SS含量隨溫度的降低逐漸升高。0℃處理下,各樹種葉片的SS含量差異不顯著(P>0.05),低于0℃后,樂東擬單性葉片的SS含量始終保持最高水平,其次為六瓣含笑,紅花深山含笑葉片的SS含量始終處于最低水平。-25℃時(shí),6種木蘭科植物葉片的SS含量從高到低依次為樂東擬單性木蘭>六瓣含笑>闊瓣含笑>雜交含笑>峨眉含笑>紅花深山含笑,分別比0℃時(shí)增加了451.35%、328.31%、265.25%、280.00%、240.98%和174.154%。可見,LT50越低的樹種在低溫下積累的SS越多。

圖2 不同低溫下6種木蘭科植物可溶性蛋白含量的變化Fig.2 Changes in soluble protein content of six varieties of Magnoliaceae under different low temperatures

圖3 不同低溫下6種木蘭科植物可溶性糖含量的變化Fig.3 Changes in soluble sugar content of six varieties of Magnoliaceae under different low temperatures

2.4 對(duì)游離脯氨酸含量的影響

在低溫脅迫過程中, 6種木蘭科植物葉片Pro含量呈先升后降的趨勢(shì)(圖4)。樂東擬單性木蘭和六瓣含笑葉片Pro含量的峰值在-20℃,闊瓣含笑、雜交含笑、峨眉含笑的峰值在-15℃,紅花深山含笑的峰值在-10℃。至峰值時(shí)6種木蘭科植物葉片的Pro含量從高到低依次為樂東擬單性木蘭>六瓣含笑>峨眉含笑>雜交含笑>闊瓣含笑>紅花深山含笑, 分別比0℃時(shí)增加了374.28%、366.91%、339.87%、319.04%、307.36%和165.78%。峰值之后,5個(gè)樹種的Pro含量呈現(xiàn)不同程度的下降,但各處理的Pro含量仍高于對(duì)照。-25℃時(shí),6種木蘭科植物Pro含量從高到低依次為樂東擬單性木蘭>六瓣含笑>峨眉含笑>闊瓣含笑>雜交含笑>紅花深山含笑, 分別比0℃時(shí)升高了410.55%、320.47%、186.47%、212.65%、195.20%和7.40%。

圖4 不同低溫下6種木蘭科植物游離脯氨酸含量的變化Fig.4 Changes in proline content of six varieties of Magnoliaceae under different low temperatures

2.5 對(duì)丙二醛含量的影響

對(duì)丙二醛(MDA)含量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各樹種葉片的MDA含量總體上呈不斷上升的趨勢(shì)(圖5)。各低溫處理下,LT50越低的樹種其葉片MDA含量越低。6個(gè)樹種在0℃時(shí)差異不顯著(P>0.05),紅花深山含笑隨著處理溫度的降低葉片MDA含量不斷增加,至-15℃后逐漸趨于平穩(wěn)。其余5個(gè)樹種在0—-10℃時(shí)葉片MDA含量升高緩慢,-15℃時(shí)MDA大量積累,-20℃后逐漸趨于平穩(wěn)。由此可見,LT50越高的木蘭科植物在低溫脅迫后其膜脂過氧化水平越高,在低溫過程中積累越多的MDA。在整個(gè)低溫過程中,MDA含量從低到高的樹種依次為樂東擬單性木蘭<六瓣含笑<闊瓣含笑<雜交含笑<峨眉含笑<紅花深山含笑。

圖5 不同低溫下6種木蘭科植物丙二醛含量的變化Fig.5 Changes in MDA content of six varieties of Magnoliaceae under different low temperatures

2.6 對(duì)SOD和POD活性的影響

從圖6和圖7可以看出,在低溫脅迫過程中,6種木蘭科植物葉片SOD和POD活性的變化趨勢(shì)基本相似,即均呈先升高后降低的趨勢(shì)且各樹種葉片SOD和POD活性在臨近LT50節(jié)點(diǎn)溫度時(shí)顯著下降(P<0.05)。0℃—-5℃下,樂東擬單性木蘭和六瓣含笑葉片SOD和POD活性顯著低于其他4個(gè)樹種(P<0.05)；至-10℃時(shí),樂東擬單性木蘭和六瓣含笑葉片SOD和POD活性顯著升高(P<0.05),-20℃時(shí)達(dá)到峰值,SOD活性分別比0℃時(shí)增加了159.83%和81.65%,POD活性分別比0℃時(shí)增加了542.93%和127.87%,闊瓣含笑、雜交含笑、峨眉含笑葉片SOD和POD在-10℃仍保持較高活性,深山含笑葉片中SOD和POD活性此時(shí)卻顯著下降(P<0.05)；當(dāng)溫度降至-25℃時(shí),樂東擬單性木蘭葉片SOD活性較0℃時(shí)差異不顯著(P>0.05),六瓣含笑、闊瓣含笑、雜交含笑、峨眉含笑和紅花深山含笑的SOD活性分別比0℃時(shí)下降了31.33%、73.39%、74.98%、83.73%和96.22%;樂東擬單性木蘭和六瓣含笑的POD活性仍比0℃時(shí)增加了147.08%和16.77%,闊瓣含笑、雜交含笑、峨眉含笑和紅花深山含笑的POD活性較0℃時(shí)顯著降低(P<0.05),分別下降了71.28%、81.89%、86.94%和98.74%。

圖6 不同低溫下6種木蘭科植物超氧化物歧化酶活性的變化Fig.6 Changes in superoxide activities of six varieties of Magnoliaceae under different low temperatures

圖7 不同低溫下6種木蘭科植物過氧化物歧化酶活性的變化Fig.7 Changes in peroxide activities of six varieties of Magnoliaceae under different low temperatures

2.7 6種木蘭科植物的抗寒性評(píng)價(jià)

2.7.1各生理指標(biāo)與LT50之間的相關(guān)性分析及抗寒關(guān)鍵生理指標(biāo)的篩選

采用相關(guān)分析法計(jì)算了各生理指標(biāo)(REC、SP、 SS、Pro、MDA、SOD、POD)與低溫半致死溫度(LT50)的相關(guān)系數(shù)(表3)。從表3可以看出,各指標(biāo)間存在不同程度的相關(guān)性,其中LT50與REC和MDA呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與SP、SS和Pro極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),而與SOD和POD不相關(guān)。因此,REC、SP、 SS、Pro、MDA可作為判斷6種木蘭科植物抗寒性的關(guān)鍵性指標(biāo)。REC與SP、Pro顯著負(fù)相關(guān),與MDA顯著正相關(guān)；SP與SS、Pro極顯著正相關(guān),與MDA極顯著負(fù)相關(guān),Pro與MDA極顯著負(fù)相關(guān)。

表3 6種木蘭科植物各生理指標(biāo)與LT50之間的相關(guān)性

“*”表示顯著相關(guān),P<0.05 ;“**”表示極顯著相關(guān),P<0.01

2.7.26種木蘭科植物的抗寒性評(píng)價(jià)及聚類分析

根據(jù)相關(guān)性分析結(jié)果,將與抗寒性極顯著相關(guān)的REC、SP、SS、Pro、MDA作為抗寒性綜合評(píng)價(jià)的指標(biāo),運(yùn)用隸屬函數(shù)法,計(jì)算6種木蘭科植物的隸屬函數(shù)值,按照平均隸屬度大小進(jìn)行排序(表4)。6種木蘭科植物的抗寒性強(qiáng)弱依次為：樂東擬單性木蘭>六瓣含笑>闊瓣含笑>雜交含笑>峨眉含笑>紅花深山含笑。

表4 6種木蘭科植物抗寒性綜合評(píng)價(jià)

對(duì)6種木蘭科植物的抗寒平均隸屬函數(shù)值進(jìn)行聚類分析(圖8),可將6種木蘭科植物的抗寒性分為三類。樂東擬單性木蘭和六瓣含笑為第一類,抗寒性強(qiáng)；闊瓣含笑、雜交含笑和峨眉含笑為第二類,抗寒性中等；紅花深山含笑為第三類,抗寒性弱,這與采用電導(dǎo)法計(jì)算的的LT50結(jié)果基本一致。

圖8 6種木蘭科植物的抗寒性的聚類分析 Fig.8 Cold resistances variable cluster analysis of six varieties of Magnoliaceae

2.8 低溫脅迫下HSP90和WRKY33基因的差異表達(dá)分析

圖9和圖10為在連續(xù)低溫脅迫下耐寒相關(guān)基因HSP90、WRKY33在6個(gè)樹種葉片中的表達(dá)均呈先升高后降低的趨勢(shì)。0℃時(shí),2個(gè)基因在6種木蘭科植物間的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)；-5℃時(shí),6種木蘭科植物為了抵御和適應(yīng)低溫脅迫造成的傷害,啟動(dòng)低溫應(yīng)答機(jī)制,激活了耐寒相關(guān)基因的表達(dá)；臨近-10℃時(shí),2個(gè)基因在耐寒性最差的紅花深山含笑葉片中的表達(dá)被強(qiáng)烈抑制且后期表達(dá)量不可逆,而在其他5個(gè)樹種中的表達(dá)被進(jìn)一步激活；-15℃時(shí),2個(gè)基因在抗寒性中等的闊瓣含笑、雜交含笑、峨眉含笑中亦被強(qiáng)烈抑制,在抗寒性強(qiáng)的樂東擬單性木蘭和六瓣含笑中的表達(dá)仍被進(jìn)一步激活；-20℃以后,2個(gè)基因在6個(gè)樹種中的表達(dá)均被抑制,表達(dá)量降低,各樹種所受傷害達(dá)不可逆轉(zhuǎn)的狀態(tài)。各樹種在LT50低溫之前,2個(gè)耐寒基因在葉片中的相對(duì)表達(dá)量呈上升趨勢(shì),當(dāng)溫度臨近其LT50時(shí),2個(gè)基因的表達(dá)被強(qiáng)烈抑制。-5℃—-25℃之間,HSP90、WRKY33基因在樂東擬單性木蘭中的相對(duì)表達(dá)量最高,其次為六瓣含笑,紅花深山含笑的相對(duì)表達(dá)量最低,說明6種木蘭科植物可通過HSP90、WRKY33基因的增強(qiáng)表達(dá)來適應(yīng)低溫逆境,低溫激活了耐寒樹種中抗寒基因的表達(dá),抑制了不耐寒樹種中抗寒基因的表達(dá),在LT50節(jié)點(diǎn)溫度之前,HSP90、WRKY33基因的相對(duì)表達(dá)量越高的樹種耐寒性越強(qiáng)。

圖9 低溫下HSP90基因的在6種木蘭科植物中的表達(dá)模式Fig.9 The expression ofHSP90 gene in six varieties of Magnoliaceae under low temperature conditions

圖10 低溫下WRKY33基因的在6種木蘭科植物中的表達(dá)模式Fig.10 The expression ofWRKY33 gene in six varieties of Magnoliaceae under low temperature conditions

3 討論

3.1 葉片相對(duì)電導(dǎo)率及其低溫半致死溫度與抗寒性

低溫脅迫下,植物發(fā)生一系列生理生化變化以適應(yīng)低溫逆境[53- 54]。生物膜是植物細(xì)胞與外界環(huán)境之間發(fā)生物質(zhì)交換的通道,細(xì)胞膜系統(tǒng)是植物受低溫傷害的原發(fā)部位[55]。相對(duì)電導(dǎo)率(REC)的變化反映細(xì)胞膜透性的改變,植物在逆境條件下細(xì)胞膜透性增大,胞內(nèi)電解質(zhì)外滲,電導(dǎo)率也隨之增大。因此,葉片相對(duì)電導(dǎo)率常作為鑒定植物細(xì)胞膜破壞程度的重要參考指標(biāo)[56- 57]。本研究表明, 6種木蘭科植物葉片相對(duì)電導(dǎo)率隨溫度的降低基本呈逐漸升高的趨勢(shì)?？梢?低溫脅迫使6種木蘭科植物葉片生物膜透性增大并且膜受損程度加重。低溫半致死溫度(LT50)能較直觀準(zhǔn)確地反映植物的抗寒力和耐低溫極限的高低,LT50越低,植物的抗寒性越強(qiáng)[58- 59]。當(dāng)溫度低于LT 50時(shí),植物細(xì)胞組織將迅速結(jié)冰,生理代謝改變,凍害發(fā)生,植物本身所受到的傷害也將不能恢復(fù)[60- 61]。因此,認(rèn)為 LT 50是植物組織所受傷害不可逆轉(zhuǎn)時(shí)的轉(zhuǎn)折溫度。本研究表明,6種木蘭科植物的LT50在-22.06—-10.64℃,從低到高的順序?yàn)椋簶窎|擬單性木蘭<六瓣含笑<闊瓣含笑<雜交含笑<峨眉含笑<紅花深山含笑。研究植物在低溫脅迫下尤其是在LT 50 溫度前后生理變化及耐寒相關(guān)調(diào)控基因的差異表達(dá)對(duì)于揭示其抗寒生理和分子機(jī)理具有重要意義。

3.2 葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量與抗寒性

可溶性蛋白(SP)是植物重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),與植物耐寒性密切相關(guān)[62]。研究表明,受與冷脅迫且與能量代謝相關(guān)的差異表達(dá)蛋白基因,如蘋果酸脫氫酶、Hsp家族熱激蛋白和ATP蛋白酶等的誘導(dǎo),可溶性蛋白會(huì)發(fā)生變化,在植物響應(yīng)低溫脅迫信號(hào)途徑中發(fā)揮重要作用,參與到植物響應(yīng)脅迫中的初生代謝和次生代謝過程中[63]?？扇苄缘鞍缀康纳?會(huì)促進(jìn)下游物質(zhì)合成,為植物響應(yīng)低溫脅迫提供必需的物質(zhì)和能量,同時(shí)可以促進(jìn)細(xì)胞外代謝活動(dòng)的變化,從而恢復(fù)生物合成和碳水化合物代謝的平衡,并提高在低溫環(huán)境中存活率[64]。植物在低溫環(huán)境下,糖類代謝主要是調(diào)節(jié)生物合成和蛋白質(zhì)分解之間的平衡,可溶性蛋白的水解需要大量的相關(guān)蛋白水解酶如Clp蛋白酶和ATP蛋白酶使多肽不可逆轉(zhuǎn)地合成可溶性糖[65- 66]。在王晶懋[67]對(duì)野生百合卷丹(Liliumlancifolium)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中,發(fā)現(xiàn)相關(guān)的蛋白水解酶,如ATP蛋白酶(ATP-dependent Clp protease proteolytic subunit, Contig24056-All)在4℃脅迫2—16 h時(shí)表達(dá)量上調(diào)了1.28倍,Clp-Hke energy-dependent蛋白酶(Congtig7878-All)上調(diào)了1.56倍,并且蔗糖磷酸合成酶和葡萄糖磷酸脫氫酶(Contig7878-AU,Contig3504)分別上調(diào)了1.67倍和1.12倍。本研究在生理指標(biāo)測(cè)定中發(fā)現(xiàn),可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先升高后降低的單峰變化趨勢(shì),抗寒性越強(qiáng)的樹種在受到外界冷剌激后的蛋白質(zhì)增加幅度和降解成糖的速度比抗寒性越弱的樹種越快,這說明抗寒性越強(qiáng)的樹種在接到冷信號(hào)后能增加的細(xì)胞液濃度和降低冰點(diǎn),并快速積累蛋白質(zhì)將其轉(zhuǎn)換成糖,通過可溶性蛋白引發(fā)了一系列的生理生化反應(yīng),可溶性蛋白的轉(zhuǎn)移對(duì)其他代謝物質(zhì)合成至關(guān)重要,使植物能快速做出冷應(yīng)激反應(yīng),并很好的適應(yīng)于低溫環(huán)境,這與前人在杜鵑(Rhododendronsimsii)[68]、結(jié)縷草(Zoysiajaponica)[69]、鳶尾(Iristectorum)[70]上的研究結(jié)果一致。

植物在低溫下可通過增加游離Pro含量降低滲透勢(shì)來增強(qiáng)自身的抗寒能力[71- 72]。植物受到低溫脅迫時(shí), 游離Pro通過對(duì)蛋白質(zhì)的水合作用, 保護(hù)植物細(xì)胞的空間結(jié)構(gòu)不被傷害, 起到了對(duì)植物的保護(hù)作用[73]。Xin對(duì)擬南芥(Arabidopsisthalianal)的研究表明, 高濃度的脯氨酸是抗凍性提高的重要原因之一[74]。本研究表明,從6種木蘭科植物的Pro含量隨溫度的降低呈現(xiàn)先升高后降低的單峰變化趨勢(shì),LT50最低的樂東擬單性木蘭和六瓣含笑其Pro峰值在-20℃出現(xiàn),且整個(gè)低溫過程中其游離脯氨酸含量顯著高于其他4個(gè)樹種,這與李軼冰[75]對(duì)低溫處理下不同禾本科牧草的生理變化中的研究結(jié)論一致,說明LT50出現(xiàn)得越晚,植物積累的Pro越多,耐寒性越強(qiáng),隨著低溫脅迫程度的加劇,酶系統(tǒng)受到損害,葉片Pro合成減弱或降解速率上升,Pro含量下降。

植物在低溫環(huán)境下,通過積累可溶性糖含量來提高細(xì)胞的滲透勢(shì),降低細(xì)胞液的結(jié)冰點(diǎn),防止過度脫水,保護(hù)植物組織免受低溫傷害[76]。本研究表明, 隨著處理溫度的降低, 6種木蘭科植物葉片中的SS含量呈逐漸增加并趨于平穩(wěn)的態(tài)勢(shì),這與在玉米(Zeamays)、番茄(Lycopersiconesculentum)[77]和甘蔗(Saccharumofficinarum)[78]上的結(jié)果一致。LT50最低的樂東擬單性木蘭其SS含量均顯著高于其他 5個(gè)樹種,抗寒性最強(qiáng),其次為六瓣含笑,紅花深山含笑SS含量最低,這說明LT50越低的樹種在低溫下積累的SS越多,抗寒性越強(qiáng),這與 Yang等[79]在紅花玉蘭(Magnoliawufengensis)上的研究結(jié)果一致。

3.3 葉片丙二醛含量和抗氧化酶活性與抗寒性

低溫脅迫會(huì)促進(jìn)胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生,過多的ROS易誘發(fā)膜脂過氧化,進(jìn)而導(dǎo)致膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的大量積累[80- 81]。Campos等[82]認(rèn)為可利用MDA含量的高低來反映膜脂過氧化的水平,細(xì)胞膜質(zhì)受損的程度以及植物抵御逆境能力的強(qiáng)弱。因此,MDA含量可作為判斷植物受低溫傷害高低的指標(biāo)之一[25]。本研究中,6種木蘭科植物的葉片MDA含量隨低溫脅迫的增強(qiáng)總體呈上升趨勢(shì),說明隨溫度的不斷降低,植物膜質(zhì)過氧化程度逐漸加重,LT50越低的樹種其葉片MDA含量上升的幅度越小,峰值之后,由于細(xì)胞大量死亡,MDA含量增加緩慢,曲線趨于緩和,這與在柑橘(Citrusreticulata)[83]和水稻(Oryzasativa)[84]上的研究結(jié)果一致。LT50最低的樂東擬單性木蘭葉片在處理間一直保持較低水平MDA,這表明樂東擬單性木蘭在低溫脅迫下膜脂過氧化程度弱,表現(xiàn)出高效清除ROS的能力和很強(qiáng)的抗寒能力。MDA增幅的大小順序與6種木蘭科植物抗寒性強(qiáng)弱的排列順序相反,這與陳潔[85],鄧仁菊等[86],Wang等[87]和張艷俠等[88]的研究結(jié)果一致。SOD和POD作為抗氧化防御系統(tǒng)可以清除氧自由基,對(duì)保護(hù)植物正常生理功能、增強(qiáng)植物抵御逆境等具有重要作用[89]。本研究中,6種木蘭科植物葉片總體呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì),SOD活性和POD活性的增加可以減輕低溫對(duì)生物膜的迫害,說明植株對(duì)低溫產(chǎn)生了一定的響應(yīng)。但是MDA 含量的增加顯示隨溫度的降低的葉片膜脂過氧化程度仍不斷加劇。在0—-5℃下,LT50低的樂東擬單性木蘭和六瓣含笑葉片SOD、POD活性卻較其他4個(gè)樹種低,可能因?yàn)闃浞N本身具有抵抗低溫的能力,并不依賴于激活葉片中保護(hù)酶活性來增強(qiáng)對(duì)樹體的保護(hù),隨著溫度的進(jìn)一步降低,樂東擬單性木蘭和六瓣含笑葉片中SOD、POD活性被激活來抵御低溫的傷害,這也可能影響并導(dǎo)致了在相關(guān)性分析中SOD、POD活性與LT50不相關(guān),但這一結(jié)論并不與SOD、POD酶具有增強(qiáng)植物抵御逆境能力相矛盾,只是由于樹種本身抗寒性的差異。在0—-10℃環(huán)境下SOD、POD酶活與6種木蘭科植物的抗寒性不相關(guān),不能作為判斷其抗寒性的關(guān)鍵指標(biāo),這與陳潔[90]在3種含笑屬植物和周建等[91]在廣玉蘭(Magnoliagrandiflora)上的研究結(jié)論一致。6種木蘭科植物在臨近其LT50節(jié)點(diǎn)溫度時(shí)SOD和POD活性均顯著下降,說明LT50的重度低溫脅迫會(huì)抑制其體內(nèi)的抗氧化酶活性,從而對(duì)細(xì)胞造成傷害,在樹種LT50范圍內(nèi)SOD和POD活性的增強(qiáng)可以抵御低溫對(duì)細(xì)胞造成的氧化傷害。

3.4 抗寒相關(guān)調(diào)節(jié)基因HSP90和WRKY33與抗寒性

低溫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)境因素之一,植物啟動(dòng)了多種防御性機(jī)制適應(yīng)冷應(yīng)力[87]。由轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)是最為快速有效的防御應(yīng)答反應(yīng)之一,構(gòu)成了植物復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分[92- 93]。大量的研究表明,各種熱休克蛋白HSPs和WRKY轉(zhuǎn)錄因子在溫度感知和信號(hào)處理中起著核心作用。熱激轉(zhuǎn)錄因子HSP在逆境脅迫下與熱激元件(heat shock element,HSE)識(shí)別并特異結(jié)合,從而激活下游基因HSP的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[94],對(duì)植物抵抗逆境傷害和其他生命活動(dòng)具有關(guān)鍵作用[95]。HSP90屬于HSPs的家族成員,是類固醇受體和激酶信號(hào)通路的組成部分,能夠促進(jìn)目標(biāo)蛋白積累和激酶激活,整合植物的晝夜節(jié)律和質(zhì)體信號(hào)通路,調(diào)控CBF和COR表達(dá)[96- 97]。WRKY33是WRKY家族的一員,是植物特異性重要的轉(zhuǎn)錄因子,參與植物眾多生理過程并在植物低溫防御應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。研究表明,低溫下,能夠誘導(dǎo)HSP90和WRKY33基因的表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)擬南芥幼苗的生長(zhǎng)[87]。低溫脅迫下,通過誘導(dǎo)HSP和WRKY基因過量表達(dá)來清除植物體內(nèi)的活性氧,以抵御氧化脅迫導(dǎo)致的傷害[98]。本研究中,HSP90、WRKY33基因總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),這種表達(dá)模式與SP、Pro、SOD、POD在6個(gè)樹種中的變化相似,說明HSP90、WRKY33可能參與到目標(biāo)蛋白的積累和激酶的激活。0℃時(shí),HSP90和WRKY33基因在6個(gè)樹種間的表達(dá)量差異都不顯著,到了臨近各樹種的LT50時(shí),2個(gè)基因在各樹種葉片中的表達(dá)被強(qiáng)烈抑制,后期表達(dá)量不可逆且隨溫度降低逐漸下降,這說明低溫脅迫導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和功能受到破壞,細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)的外滲量增多,相對(duì)電導(dǎo)率迅速升高,進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)生理生化活動(dòng)發(fā)生改變,使其對(duì)低溫脅迫的應(yīng)答調(diào)控機(jī)制受到影響,耐寒調(diào)控基因的表達(dá)受到抑制。低溫過程中,耐寒種質(zhì)樂東擬單性木蘭和六瓣含笑中HSP90和WRKY33的表達(dá)量始終高于其他樹種。這表明6種木蘭科植物在耐寒生理響應(yīng)和相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)水平上,樹種抗寒性強(qiáng)度不同對(duì)低溫的應(yīng)答機(jī)制也存在差異,耐寒性越強(qiáng)的樹種為了抵御和適應(yīng)低溫脅迫造成的傷害,越會(huì)快速啟動(dòng)低溫應(yīng)答機(jī)制,激活HSP90和WRKY33基因的表達(dá),進(jìn)而啟動(dòng)下游與耐寒相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)整植物體內(nèi)的生理生化活動(dòng),增強(qiáng)ROS清除能力,減輕氧化脅迫造成的傷害,尤其在臨近葉片組織受到不可逆轉(zhuǎn)傷害的溫度節(jié)點(diǎn),這種由調(diào)控基因介導(dǎo)的耐寒調(diào)節(jié)機(jī)制被充分調(diào)動(dòng),以提高自身的抗寒能力,而后期表達(dá)量下降的原因,可能與對(duì)低溫環(huán)境的適應(yīng)有關(guān),低溫已經(jīng)不再誘導(dǎo)HSP90和WRKY33基因的表達(dá),也可能說明HSP90和WRKY33基因的誘導(dǎo)受脅迫溫度的限制,低于一定的低溫耐寒基因的表達(dá)將逐漸受到抑制,對(duì)低溫的耐受性也不斷降低[99],這種隨低溫脅迫時(shí)間的持續(xù),轉(zhuǎn)錄因子先升高后下降的表達(dá)模式也在對(duì)水稻耐低溫[100]和短枝木麻黃(Casuarinaequisetifolia)[52]等的研究上得到了相似結(jié)果。

4 結(jié)論

平均隸屬函數(shù)法可以用于木蘭科抗寒種質(zhì)資源的鑒定和抗寒新品種的選育。

6種木蘭科植物的LT50在-10.64℃—-22.06℃,從低到高的順序?yàn)椋簶窎|擬單性木蘭<六瓣含笑<闊瓣含笑<雜交含笑<峨眉含笑<紅花深山含笑。低溫過程中,SP、Pro呈先升高后降低的變化趨勢(shì),SS、MDA則不斷積累。相關(guān)分析表明, LT50與REC和MDA呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與SP、SS和Pro極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),而與SOD和POD不相關(guān)。因此,REC、MDA、SP、SS和Pro可作為6種木蘭科植物抗寒性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵性指標(biāo),POD、SOD酶活性則不建議作為判斷植物抗寒性的主要依據(jù)。

6種木蘭科植物的抗寒性從強(qiáng)到弱依次為：樂東擬單性木蘭>六瓣含笑>闊瓣含笑>雜交含笑>峨眉含笑>紅花深山含笑。聚類分析表明,樂東擬單性木蘭和六瓣含笑抗寒性強(qiáng),闊瓣含笑、雜交含笑和峨眉含笑抗寒性中等,紅花深山含笑抗寒性弱。

在抗寒相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)水平上,6種木蘭科植物對(duì)低溫的應(yīng)答機(jī)制明顯不同。低溫激活了抗寒種質(zhì)中HSP、WRKY基因的增強(qiáng)表達(dá)以抵御和適應(yīng)逆境脅迫,但抑制了在不抗寒種質(zhì)中的表達(dá),顯著降低了不抗寒種質(zhì)對(duì)低溫逆境的耐受能力。

本研究在一定程度上對(duì)于豐富木蘭科植物適應(yīng)低溫的分子和生理機(jī)制,以及抗寒無性系的分子選育都具有一定的參考價(jià)值。然而要全面深入解析木蘭科植物抗寒的分子機(jī)制,還需要增加更多抗寒相關(guān)候選基因的表達(dá)模式研究,并進(jìn)一步開展功能分析。因此,克隆基因全長(zhǎng)、構(gòu)建抗寒木蘭科植物功能基因超表達(dá)載體、建立遺傳轉(zhuǎn)化體系等將是未來工作重點(diǎn)。