大豆根瘤內(nèi)生菌全細(xì)胞可溶性蛋白SDS-PAGE電泳圖譜分析

徐亞軍，李珂，劉珂珂，袁圓圓，孫笑顏，趙龍飛，2，*

（1.商丘師范學(xué)院 生物與食品學(xué)院，河南 商丘 476000；2.河南省特色微生物資源開(kāi)發(fā)與應(yīng)用工程研究中心，河南 商丘 476000）

植物內(nèi)生菌是指生活在特定階段能與植物形成互利關(guān)系的微生物，種類(lèi)繁多、分布廣泛[1]。大多數(shù)內(nèi)生菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)對(duì)植物生長(zhǎng)有益，成為植物微生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分[2]。由于植物內(nèi)生菌具有促進(jìn)宿主氮代謝[3]、修復(fù)重金屬污染[4]、抑制病原菌生長(zhǎng)[5]、促進(jìn)植物生長(zhǎng)等多種功能[6-7]。因此，對(duì)植物內(nèi)生菌的研究成為國(guó)內(nèi)外微生物資源研究的焦點(diǎn)[8-11]，但目前對(duì)豆科植物根瘤內(nèi)生菌的研究相對(duì)較少。對(duì)內(nèi)生細(xì)菌分類(lèi)研究一般采用形態(tài)學(xué)、生理生化特性和16S rDNA測(cè)序方法，但對(duì)于某些菌株，該方法只能初步確定其類(lèi)別且工作量較大[12]?；诖耍疚囊源蠖垢鰞?nèi)生菌為試驗(yàn)材料，對(duì)其進(jìn)行全細(xì)胞可溶性蛋白質(zhì)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 圖譜分析，以期獲得分析根瘤內(nèi)生菌系統(tǒng)發(fā)育地位的一種有效輔助手段。

SDS-PAGE 是檢測(cè)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的常用試驗(yàn)技術(shù)，受到廣泛關(guān)注[13]。聚丙烯酰胺凝膠是一種透明而不溶于水并有韌性的凝膠，由N，N-亞甲叉雙丙烯酰胺和丙烯酰胺組成[13-14]。由于聚丙烯酰胺凝膠電泳具有精細(xì)度高、分子交聯(lián)度高、分辨率強(qiáng)、分離范圍窄、可分離相差較小的蛋白質(zhì)樣品等優(yōu)點(diǎn)，故在蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定中占有極其重要地位[14]。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品的相對(duì)遷移率對(duì)比，可估計(jì)待測(cè)蛋白質(zhì)樣品的相對(duì)分子質(zhì)量[15]。SDS-PAGE 主要用于提純過(guò)程中純度的檢測(cè)、藥物檢測(cè)、食品等方面，單個(gè)亞基組成的蛋白質(zhì)通常只有一條帶，但若蛋白質(zhì)是由2個(gè)或2個(gè)以上的亞基組成的，則會(huì)出現(xiàn)多個(gè)條帶[16]。由于不同分子量的蛋白質(zhì)電泳速度不同，在經(jīng)過(guò)分離膠時(shí)會(huì)形成不同遷移率的條帶，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)遷移率估計(jì)待測(cè)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量[17]。本文以大豆根瘤內(nèi)生菌為試驗(yàn)材料，采用5%分離膠，對(duì)其進(jìn)行全細(xì)胞可溶性蛋白質(zhì)SDS-PAGE 圖譜分析，比較大豆根瘤內(nèi)生菌蛋白質(zhì)電泳條帶圖譜間的聯(lián)系和區(qū)別，確定根瘤內(nèi)生菌16S rDNA 分子鑒定結(jié)果間的對(duì)應(yīng)性[18]，探索SDSPAGE 在內(nèi)生菌鑒定過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)菌株：大豆根瘤內(nèi)生菌 7、21、44、52、53、70、72、123、125、132、161、166、170、210、254 是課題組（U1204301“大豆根瘤內(nèi)生菌對(duì)小麥的促生作用機(jī)理研究”）分離、純化和保藏。

十二烷基硫酸鈉、聚丙烯酰胺：北京索萊寶科技有限公司；過(guò)硫酸銨、溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)G250：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蛋白質(zhì)marker：上海翊圣生物科技有限公司；甘氨酸、酵母膏、胰蛋白胨、三羥甲基氨基甲烷：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PV-30/70 超凈工作臺(tái)：西班牙泰事達(dá)公司；MLS-375 高壓滅菌鍋：日本三洋電氣有限公司；Anke TDL-5-A 離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；QT-2 智能漩渦混合器：上海琪特分析儀器有限公司；ZHP-100 恒溫震蕩培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；HP1000GC 智能人工氣候箱：武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；pHs-3E pH 計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；JY600 電泳儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 分離膠制備和溶液配制

10%濃度分離膠制備：重蒸水4.0 mL，30%聚丙烯酰胺2.6 mL，三羥甲基氨基甲烷-鹽酸[tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris-HCl]2.6 mL，10 %過(guò)硫酸銨 100 μL，10%SDS 100 μL，四甲基乙二胺（N，N，N'，N'-Tetramethylethylenediamine，TEMED）6 μL。

5%濃度分離膠制備：ddH2O 3.4 mL，30 %聚丙烯酰胺 0.83 mL，Tris-HCl 0.68 mL，10%過(guò)硫酸銨 50 μL，10%SDS 53 μL，TEMED 5 μL。

2×上樣緩沖液：甘油2.0 mL，0.5 mol/L Tris-HCl（pH6.8）2.5 mL，β-巰基乙醇 1.0 mL，質(zhì)量濃度為10%的 SDS 4.0 mL，0.1%的溴酚藍(lán)1.5 mL，總體積 10 mL（4℃冰箱保存）。

電極緩沖液（pH 8.3）：取甘氨酸 14.4 g，SDS 1.0 g，Tris 3.0 g，加重蒸水至 1 000 mL（4℃冰箱保存）。

考馬斯亮藍(lán)染色液：取91 mL 50%甲醇，0.25 g 考馬斯亮藍(lán)G-250，9 mL 冰乙酸混勻（4℃冰箱保存）。

脫色液：取 50 mL 甲醇、75 mL 冰乙酸，定容至1 000 mL（4℃冰箱保存）。

TE 緩沖液：取0.001 mol/L 乙二胺四乙酸（ethylenediaminete traacetic acid，EDTA）0.03 g，0.01 mol/L Tris 0.12 g，用冰乙酸調(diào) pH 值至 8.0，定容至 1 000 mL（4℃冰箱保存）。

LB 培養(yǎng)基的配制（1 000 mL）：酵母膏 30 g、NaCl 3 g、胰蛋白胨 10 g。

1.3.2 菌體培養(yǎng)

將待測(cè)菌株接種在LB 培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中220 r/min 28℃震蕩培養(yǎng)2 d，定期查看菌株生長(zhǎng)狀況并記錄其長(zhǎng)勢(shì)。

1.3.3 蛋白質(zhì)樣品的處理

用1 mL 移液槍抽取1 mL 菌懸液至1.5 mL 離心管中，在高速冷凍離心機(jī)2 000 r/min 離心2 min，棄上清，每管重復(fù)5 次，每株菌可設(shè)置3 管～5 管平行對(duì)照，以備用。

向離心過(guò)的管中加入50 μL 三羥甲基氨基甲烷+乙二胺四乙酸緩沖液及等量2×上樣緩沖液，密封后水浴煮沸10 min。

將煮好的蛋白質(zhì)置于高速冷凍離心機(jī)10 000 r/min離心1 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE。

1.3.4 蛋白質(zhì)Marker 的處理

向已分裝好的標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品中加入10 μL 樣品緩沖液，充分混勻后煮沸5 min。

1.3.5 制膠及電泳

稱(chēng)取適量分離膠藥品并混勻，小心加至膠板間隙中，在距玻璃板頂部2 cm 處停止灌膠，立刻在分離膠上加上一層無(wú)水乙醇。待完全聚合后，倒掉覆蓋層，用無(wú)菌水沖洗凝膠頂部數(shù)次并用濾紙吸干水分。按上述5%濃縮膠的配方稱(chēng)取適量藥品后充分混勻并緩慢灌膠，待聚合完成后拔掉梳子，用無(wú)菌水沖洗加樣孔以除去未聚合的丙烯酰胺，弄直膠齒，用事先剪好的濾紙條小心吸干加樣孔中的水分。抽掉絕緣條，將凝膠板固定在電泳裝置上并倒入電泳緩沖液使其覆蓋住加樣孔。第一個(gè)孔點(diǎn)上標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品，其它孔按順序加樣，每孔上樣量約為 5 μL～10 μL。先用 80 V 電壓電泳，當(dāng)藍(lán)色條帶遷移至濃縮膠與分離膠分界線(xiàn)時(shí)，換用110 V 電壓，當(dāng)藍(lán)色條帶遷移到分離膠底部時(shí)停止電泳。

1.3.6 染色、脫色及保存

電泳完成后，關(guān)閉電源，取下玻璃板，將膠板小心滑入盛有考馬斯亮藍(lán)G-250 染液中染色40 min 后，用脫色液脫色至條帶清晰、背景無(wú)色為止，拍照并將膠保存在20%的甘油中。

1.3.7 內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA 測(cè)序及比對(duì)

采用十六烷基三甲基溴化銨法提取內(nèi)生菌基因組DNA，以基因組DNA 為模板，進(jìn)行16S rDNA 擴(kuò)增、測(cè)序，所用引物、擴(kuò)僧體系、反應(yīng)條件見(jiàn)參考文獻(xiàn)[18]。根據(jù)測(cè)序所得序列在GenBank中進(jìn)行基本局部序列比對(duì)（basic local alignment search tool，BLAST）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單次點(diǎn)樣的SDS-PAGE圖譜比較

菌株的單次點(diǎn)樣SDS-PAGE 圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 菌株的單次點(diǎn)樣SDS-PAGE 圖譜Fig.1 Electrophoretogram of SDS-PAGE tested strains with single point

由圖1可知，測(cè)試菌株均具有多條帶，由多個(gè)蛋白質(zhì)亞基組成。不同菌株電泳后所得條帶相似程度不同。菌株70 與72 的蛋白質(zhì)白圖譜有近似條帶，但在35 kD～135 kD 間蛋白質(zhì)條帶差異較大。

試驗(yàn)菌株的16S rDNA 測(cè)序比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表1。

根據(jù)16S rDNA 測(cè)序比對(duì)結(jié)果（表1），兩者最相似屬種分別為Ochrobactrum intermedium、Bacillus tequi－lensis/subtilis，說(shuō)明兩者之間在屬水平上存在差異。72和210 的蛋白質(zhì)圖譜及其相似，16S rDNA 測(cè)序比對(duì)結(jié)果表明，二者最相似菌株均為Bacillus tequilensis/subtilis。其他幾株菌的電泳圖譜存在較大差異，16S rDNA測(cè)序顯示，菌株 44、52、161、166、170、254 的最相似屬種分別為 Bacillus horikoshii、Sinorhizobium fredii、Acinetobacter calcoaceticus、Pseudomonas geniculate、Stenotrophomonas sp、Enterobacter ludwigii，可見(jiàn)菌株彼此間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，蛋白質(zhì)電泳結(jié)果與16S rDNA 測(cè)序結(jié)果一致，說(shuō)明大豆根瘤內(nèi)生菌電泳圖譜與16S rDNA 分子鑒定結(jié)果間具有一定的對(duì)應(yīng)性。因此，SDS-PAGE 在對(duì)內(nèi)生菌輔助鑒定過(guò)程中是一種有效的方法與手段。

表1 測(cè)試菌株16S rDNA 測(cè)序比對(duì)結(jié)果Table 1 The 16S rDNA sequences alignment results of tested strains

2.2 重復(fù)點(diǎn)樣的SDS-PAGE電泳圖譜比較

內(nèi)生菌 7、21、53 的的 3 次點(diǎn)樣 SDS-PAGE 電泳圖譜見(jiàn)圖2。

圖2 內(nèi)生菌7、21、53 的SDS-PAGE 電泳圖譜3 次點(diǎn)樣比較（M：蛋白質(zhì)標(biāo)記）Fig.2 Electrophoretogram of SDS-PAGE tested strains 7，21，53 with three repeats（M：protein marker）

從圖2可知，每個(gè)測(cè)試菌株均有多個(gè)條帶，菌株圖譜條帶間存在較大的差異。同一株菌3 次平行點(diǎn)樣的蛋白質(zhì)圖譜完全一致，說(shuō)明重復(fù)點(diǎn)樣不影響蛋白質(zhì)亞基的分子量。經(jīng)16S rDNA 測(cè)序比對(duì)表明，重復(fù)點(diǎn)樣后同一株菌的最相似屬種不變，說(shuō)明根據(jù)條帶判斷親緣關(guān)系是可靠的。電泳結(jié)果顯示，與菌株7 與53 相比，菌株21 圖譜條帶較多且密，說(shuō)明菌株21 與菌株7 和53親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。菌株7 與53 的蛋白質(zhì)電泳條帶相似度較高，而16S rDNA 測(cè)序結(jié)果表明，菌株7 與53 最相似屬種均為Bacillus subtilis，最相似菌株均為HRA69 且相似度均為100%，這充分說(shuō)明菌株7 與53 為同一株菌，而菌株21 最相似屬種為Enterobacter ludwigii，與7和53 在屬種進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。蛋白質(zhì)電泳圖譜結(jié)果與16S rDNA 序列比對(duì)結(jié)果一致，再次說(shuō)明SDS-PAGE 在對(duì)內(nèi)生菌輔助鑒定過(guò)程中是一種有效的方法和手段。

內(nèi)生菌 123、125、132 的 SDS-PAGE 電泳圖譜 3次點(diǎn)樣圖譜見(jiàn)圖3。

圖3 內(nèi)生菌 123、125、132 的 SDS-PAGE 電泳圖譜 3 次點(diǎn)樣（M：蛋白標(biāo)記）Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of endophytic bacteria 123，125，132 with three repeats（M：protein marker）

從圖3可知，上述3 株菌均有多個(gè)蛋白質(zhì)條帶，均含有多個(gè)蛋白質(zhì)亞基。同一株菌3 次重復(fù)點(diǎn)樣的蛋白質(zhì)亞基相對(duì)遷移率幾乎完全一致，重復(fù)點(diǎn)樣不影響蛋白質(zhì)亞基的分子量。經(jīng)16S rDNA 測(cè)序比對(duì)分析，重復(fù)點(diǎn)樣同一株菌的最相似屬種不變，重復(fù)點(diǎn)樣進(jìn)行點(diǎn)樣不影響親緣關(guān)系。電泳結(jié)果顯示，3 株菌在凝膠底部的圖譜一致且顏色深淺無(wú)差異，說(shuō)明三者的蛋白質(zhì)含量及分子量均接近。菌株123 與132 的蛋白質(zhì)圖譜有相似之處，但菌株125 蛋白質(zhì)圖譜與123 和132 差別較大，說(shuō)明彼此間親緣關(guān)系遠(yuǎn)。16S rDNA 比對(duì)結(jié)果顯示，123 最相似屬種為Bacillus cereus、132 最相似屬種為Bacillus aryabhattai、125 最相似屬種為 Bacillus cereus，說(shuō)明123 與125 親緣關(guān)系較近，與132 親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)。上述結(jié)果說(shuō)明僅僅根據(jù)蛋白質(zhì)電泳圖譜只能大致鑒定內(nèi)生菌的親緣關(guān)系，若需準(zhǔn)確鑒定，還需經(jīng)過(guò)16S rDNA 測(cè)序。

2.3 同一株菌上樣量不同的SDS-PAGE圖譜分析

菌株 7、21、53 不同上樣量的 SDS-PAGE 圖譜見(jiàn)圖4。

圖4 菌株7、21、53 不同上樣量的SDS-PAGE 圖譜（M：蛋白標(biāo)記）Fig.4 SDS-PAGE profiles of different sample volume strain 7，21，53（M：protein marker）

從圖4可知，上樣量為 7 μL 和 14 μL 時(shí)電泳后蛋白質(zhì)條帶蛋白質(zhì)亞基的相對(duì)遷移率沒(méi)有變化，只是后者顏色較深，這說(shuō)明蛋白質(zhì)分子量不隨點(diǎn)樣量的變化而變化，但蛋白質(zhì)含量與點(diǎn)樣量成正比。經(jīng)16S rDNA測(cè)序比對(duì)結(jié)果表明，不同上樣量會(huì)導(dǎo)致電泳條帶顏色深淺不同而序列比對(duì)結(jié)果不變，菌株7 與53 最相似屬種均為Bacillus subtilis。而菌株21 最相似屬種始終為Enterobacter ludwigii，這說(shuō)明上樣量不同時(shí)不影響對(duì)菌株間親緣關(guān)系的判斷，16S rDNA 測(cè)序結(jié)果與此次電泳試驗(yàn)結(jié)果一致，再次說(shuō)明SDS-PAGE 在對(duì)內(nèi)生菌輔助測(cè)定過(guò)程中是一種有效的方法與手段。

內(nèi)生菌 123、125、132 不同上樣量的 SDS-PAGE圖譜見(jiàn)圖5。

圖5 菌株123、125、132 不同上樣量的SDS-PAGE 圖譜（M：蛋白標(biāo)記）Fig.5 The SDS-PAGE electrophoresis of 123，125，132 different sample volume with repeats（M：protein marker）

從圖5可知，上樣量為 7 μL 和 14 μL 時(shí)蛋白質(zhì)條帶電泳后各蛋白質(zhì)亞基的相對(duì)遷移率幾乎沒(méi)有變化，只是顏色深淺有稍微變化，這說(shuō)明分子量不隨點(diǎn)樣量的變化而變化，但蛋白質(zhì)含量與點(diǎn)樣量成正比。經(jīng)16S rDNA 測(cè)序比對(duì)分析表明，上樣量不同時(shí)，菌株123 的最相似屬種始終為Bacillus cereus、菌株125 的最相似屬種始終為Bacillus cereus、菌株132 的最相似屬種始終為Bacillus aryabhattai，且三者最相似菌株也不因上樣量不同而變化，說(shuō)明上樣量不同不影響對(duì)親緣關(guān)系遠(yuǎn)近的判斷。16S rDNA 測(cè)序結(jié)果與此次電泳試驗(yàn)結(jié)果一致，再次說(shuō)明SDS-PAGE 是一種鑒定內(nèi)生菌的有效輔助手段。

3 結(jié)論與討論

大豆根瘤內(nèi)生菌蛋白質(zhì)條帶與菌株16S rDNA 序列比對(duì)結(jié)果的關(guān)系。植物內(nèi)生菌種類(lèi)繁多，獲得優(yōu)良菌株并對(duì)其測(cè)序和序列比對(duì)是研究?jī)?nèi)生菌的首要問(wèn)題，一直受到廣泛關(guān)注[19]。Schagger H 等[14]在 20世紀(jì)首次利用16S rDNA 的序列構(gòu)建了PCR 引物，通過(guò)擴(kuò)增和DNA 測(cè)序，鑒定未知功能的細(xì)菌，開(kāi)辟了使用16S rD NA 序列分析未知細(xì)菌的先例。由于16SrDNA 廣泛存在于原核生物中，且具有種屬特異性，故16S rDNA 序列分析法逐漸成為鑒定植物內(nèi)生菌種類(lèi)的常用方法[20-22]。本試驗(yàn)從大豆根瘤中篩選優(yōu)良菌株，并對(duì)其可溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)，將所得結(jié)果與16S rDNA 測(cè)序比對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行分析[20]。結(jié)果表明，菌株7 與53的蛋白圖譜大致相同，幾乎沒(méi)有差異。經(jīng)16S rDNA 測(cè)序比對(duì)分析，兩者最相似屬種均為Bacillus subtilis，說(shuō)明兩者很可能是同一種內(nèi)生菌。湯旭等[21]通過(guò)對(duì)布魯氏菌進(jìn)行16S rDNA 測(cè)序分析，得出在布魯氏菌中相似度極高，與本試驗(yàn)結(jié)論一致。電泳結(jié)果顯示，對(duì)同一菌株不同上樣量不影響蛋白質(zhì)圖譜，經(jīng)16S rDNA 測(cè)序，同一菌株的最相似屬種始終不變。陳亞飛等[23]通過(guò)對(duì)蛇毒抗瘤蛋白質(zhì)的測(cè)定得出，含量較高、上樣量過(guò)高的條帶區(qū)分不明顯，而上樣量過(guò)低、蛋白質(zhì)含量低的條帶不能顯示?？梢?jiàn)，上樣量過(guò)低時(shí)影響蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確性，而上樣量過(guò)高時(shí)影響蛋白質(zhì)條帶的清晰度，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的分離鑒定[24]。根據(jù)內(nèi)生菌SDS-PAGE電泳圖譜與16S rDNA 測(cè)序結(jié)果對(duì)比可知，內(nèi)生菌中某些不同屬種之間的蛋白質(zhì)圖譜存在差異，而相同屬種之間的蛋白質(zhì)圖譜完全相同，上述結(jié)論對(duì)大豆根瘤內(nèi)生菌的研究和初步判斷提供了有效的方法和基礎(chǔ)，但在準(zhǔn)確判斷內(nèi)生菌的種屬關(guān)系時(shí)，還要采用其它手段進(jìn)一步鑒定[24]。

凝膠濃度對(duì)電泳結(jié)果的影響。由于SDS 的加入，使蛋白質(zhì)樣品帶上大量負(fù)電荷從而掩蓋了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，故在SDS-PAGE 電泳中樣品的遷移速度只取決于其相對(duì)分子質(zhì)量而與其所帶的電荷及分子的形狀無(wú)關(guān)[15]。張露露等[25]試驗(yàn)得出可通過(guò)膠板蛋白質(zhì)分子量大小取決于分離的膠濃度大小，凝膠濃度低時(shí)適合分離分子量較大的蛋白質(zhì)，而凝膠濃度高時(shí)適合分離分子量較小的蛋白質(zhì)，又由于蛋白質(zhì)分子量小、電泳速度快，蛋白質(zhì)樣品容易跑出膠板，造成蛋白質(zhì)條帶的缺失[24]，總體上，相對(duì)分子質(zhì)量越小所用凝膠濃度就越大[13-14]，在本試驗(yàn)中采用了5%的濃度，所以試驗(yàn)效果不佳，出現(xiàn)了“拖尾”及“微笑”帶等一系列現(xiàn)象。在進(jìn)行SDS-PAGE 時(shí)可通過(guò)對(duì)比不同濃度凝膠的分離效果確定最適濃度。

電泳前煮沸是否充分對(duì)電泳結(jié)果的影響。電泳效果與操作流程、電泳條件等因素密切相關(guān)，其中一個(gè)因素的改變就可能會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果，故在電泳過(guò)程中應(yīng)綜合考慮各種因素[24]。電泳前一般將待測(cè)樣品煮沸以將其二硫鍵斷裂，斷裂是否充分可能會(huì)影響電泳結(jié)果。袁燕等[17]通過(guò)對(duì)蒜頭果蛋白質(zhì)進(jìn)行變性SDS-PAGE電泳，通過(guò)觀察不同處理后樣品的相對(duì)遷移率得出蒜頭果蛋白質(zhì)是由二硫鍵連接的兩個(gè)多肽鏈組成，不同處理得到的蛋白質(zhì)樣品的電泳圖譜不同。在本試驗(yàn)中，將待測(cè)樣品統(tǒng)一煮沸10 min，由于無(wú)法從表面判斷二硫鍵是否充分?jǐn)嗔?，只采用這種方法處理蛋白質(zhì)樣品顯然是不合理的，這是試驗(yàn)的不足之處。在試驗(yàn)前可設(shè)置不同煮沸時(shí)間使蛋白質(zhì)樣品不同程度的斷裂，然后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，觀察蛋白質(zhì)圖譜的差異以定制出適當(dāng)?shù)闹蠓袝r(shí)間。