氨基硅烷修飾的熒光磁性復合納米粒子的合成

朱彥濤,張志剛

(山西大學 分子科學研究所,化學生物學與分子工程教育部重點實驗室,山西 太原 030006)

0 引言

以納米粒子載運抗癌藥物正成為化學、醫(yī)學及材料科學領域的研究熱點,受到了人們的廣泛關注[1-2]。當納米粒子用于載運抗癌藥物時,可使藥物避免被人體網狀內皮組織體系清除,從而延長藥物在血液中的循環(huán)時間,還可使藥物更易進入腫瘤組織的毛細血管中,從而使藥物更高效地分布于腫瘤細胞中,為此已發(fā)展出了各種各樣的納米粒子載藥體系,如金納米粒子、聚合物納米粒子等等[3-4]。在這些眾多的納米粒子載藥體系中,氨基硅烷修飾的Fe3O4@SiO2磁性復合納米粒子因具有良好生物相容性且其表面可通過氨基偶聯(lián)各種靶向分子,引起了各國研究者的廣泛興趣[5]。目前這類復合納米粒子已被廣泛應用于生物醫(yī)學領域,如蛋白質固定、DNA純化、磁共振成像中的細胞標記等方面[6-8]。包裹熒光體的氨基硅烷修飾的Fe3O4@SiO2磁性復合納米粒子用于抗癌藥物的載體時,將會使其具有實時可追蹤的特性,有利于腫瘤的診斷和治療,因而具有重要的應用前景,但目前尚未見到包裹熒光體的氨基硅烷修飾的Fe3O4@SiO2磁性復合納米粒子的報道。本文合成了一種新的包裹熒光體羅丹明6G的氨基硅烷修飾的熒光磁性復合納米粒子,并對影響復合納米粒子的粒徑因素進行了初步探索。

1 實驗部分

1.1 材料

正硅酸乙酯(TEOS),國藥集團化學試劑公司;3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),國藥集團化學試劑公司;四甲基氫氧化銨(TMAH),阿拉丁試劑公司;羅丹明6G (R6G),西亞試劑公司;其他試劑均為分析純。

1.2 Fe3O4磁性納米粒子的合成

根據(jù)文獻方法[9]以共沉淀法制備Fe3O4磁性納米粒子。具體步驟如下:將0.65 g FeSO4·7H2O 和1.255 g FeC13·6H2O溶于40 mL蒸餾水中,攪拌并恒溫30℃的條件下,通入氮氣除氧。在持續(xù)通入氮氣和攪拌加熱條件下向反應體系中滴加5 mL濃氨水(質量分數(shù)25%),調節(jié)溶液pH=10,體系中逐漸有黑色沉淀生成。繼續(xù)反應10 min后,將反應混合物于室溫下靜置片刻。以稀氨水、蒸餾水磁分離洗滌黑色固體數(shù)次后,得到產物Fe3O4磁性納米粒子。

1.3 包裹有R6G的熒光磁性復合納米粒子的合成

稱取0.12 g羅丹明6G與2 mL APTES混合,加入5 mL乙醇使其全部溶解,避光放置18 h。將0.8 g新合成的Fe3O4分散于20 mL乙醇中,滴加濃氨水(質量分數(shù)25%)調節(jié)溶液至pH=9,超聲分散15 min。在持續(xù)攪拌下將R6G、APTES和乙醇的混合溶液逐滴加入上述體系,攪拌1 h后,將適量TEOS、TMAH及5 mL乙醇的混合溶液緩慢滴加入反應體系,室溫反應24 h后通過磁分離得到沉淀,以乙醇、少量蒸餾水交替洗滌數(shù)次后50℃烘干,得到熒光磁性復合納米粒子(Fe3O4/R6G)@SiO2。將不同反應條件下合成的產物分別標記為1a、1b、1c(見表1)。

1.4 氨基硅烷修飾的熒光磁性復合納米粒子的合成

稱取300 mg (Fe3O4/R6G)@SiO2分散于60 mL乙醇中,超聲分散30 min。量取200 μL APTES加入2.3 mL乙醇,靜置5 min后滴加到前述混合物中,以濃氨水(質量分數(shù)25%)調節(jié)體系pH=8。50℃水浴中持續(xù)攪拌下反應5 h后,磁分離得到沉淀物,并分別以蒸餾水和乙醇洗滌數(shù)次,再置于烘箱50℃烘干,得到包裹有R6G且經氨基硅烷修飾的熒光磁性復合納米粒子 (Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES。

1.5 氨基硅烷修飾的熒光磁性復合納米粒子對pBR322 DNA損傷情況的研究

利用瓊脂糖凝膠電泳法研究了(Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES對pBR322 DNA的損傷情況。如果復合納米粒子對DNA造成損傷,DNA的空間構型將可由共價閉環(huán)(ccc)轉變?yōu)殚_環(huán)(oc)甚至線性(Linear)構型,而這三種構型的DNA在電場中的遷移速率不同,因此可通過凝膠電泳法了解復合納米粒子對DNA的損傷情況。具體步驟如下:

將24.2 g Tris-base、5.71 mL冰醋酸和40 mL EDTA (0.125 mol·L-1)水溶液混合于100 mL燒杯中,再加入40 mL滅菌蒸餾水充分溶解后轉移至100 mL容量瓶,并以滅菌蒸餾水定容,得到TAE電泳液,將之搖勻后轉移至試劑瓶內保存,用時稀釋50倍。

將0.121 g Tris-base、0.036 g NaCl 溶于80 mL滅菌蒸餾水中,以鹽酸調節(jié)溶液pH值為7.26,并以滅菌蒸餾水定容于100 mL容量瓶,得到實驗所需的緩沖液。

稱取1.5 mg熒光磁性復合納米粒子超聲分散于1 mL DMF中,按照實驗需求以緩沖液稀釋成一系列不同濃度的復合納米粒子分散液,并將適量pBR322 DNA (0.5 μg/μL)以緩沖液稀釋8倍。向每個EP管中分別加入3 μL pBR322 DNA稀釋液,再分別加入7 μL不同濃度的復合納米粒子分散液。將各管混合液吹打均勻后,37℃水浴恒溫平衡30 min。再向每個EP管中分別加入2 μL 6×Glycerol Gel Loading Dye I (BPB),混合均勻后上樣于質量分數(shù)為0.8%的瓊脂糖凝膠上。

在稀釋50倍的TAE電泳液中,保持電壓65 V,電泳1 h,于凝膠成像系統(tǒng)下拍照得到凝膠電泳圖。

2 結果與討論

2.1 復合納米粒子的合成與表征

2.1.1 不同實驗條件對復合納米粒子粒徑的影響

據(jù)文獻報道,粒徑介于50～200 nm的納米粒子最容易被腫瘤細胞攝入[1],因此了解并控制復合納米粒子的粒徑對載藥納米粒子來說顯得非常重要。本文以Zetasizer Nano ZS型激光粒度儀測定了不同實驗條件下合成的包裹有R6G的熒光磁性復合納米粒子粒徑,其結果如表1所示。

表1 不同實驗條件下的1a-1c的粒徑

表1中產物1a和1b分別是在其他反應條件相同的情況下,添加TMAH和不添加TMAH時得到的復合納米粒子(Fe3O4/R6G)@SiO2,它們在水中的粒徑分別為342.0 nm 和476.5 nm。由此可見,穩(wěn)定劑TMAH的存在對納米粒子的粒徑影響顯著,這可能是由于帶正電荷的TMAH更好地防止了復合納米粒子的聚集、穩(wěn)定了復合納米粒子并使之分散性增強的緣故。此外,從表1還可看出,TEOS的用量不宜過大,增大TEOS的用量會使復合納米粒子的粒徑增大。因此,在制備(Fe3O4/R6G)@SiO2的過程中,產物1b的合成條件最為合適。

2.1.2 紅外譜圖分析

由圖1可見,(Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES的紅外光譜中,2 926 cm-1可歸屬為APTES的氨丙基的-CH2-基團的振動[10],1 564 cm-1可歸屬為APTES上—NH2的彎曲振動[11],1 385 cm-1則對應于Si—CH2的剪式振動[12]。紅外光譜的數(shù)據(jù)表明,氨基硅烷已成功地修飾到了(Fe3O4/R6G)@SiO2的表面。

2.1.3 (Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES的DLS表征

將少量(Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES超聲分散于超純水中得到該樣品分散液,以Zetasizer Nano ZS型激光粒度儀測得其ζ電位為20.0 mV,見圖2。結果表明該熒光磁性復合納米粒子表面帶正電荷,進一步證實氨基硅烷已成功修飾于(Fe3O4/R6G)@SiO2表面。

Fig.1 IR spectra: (a) (Fe3O4/R6G)@SiO2(1b),(b) (Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES圖1 紅外光譜:(a) (Fe3O4/R6G)@SiO2(1b),(b) (Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES

Fig.2 Zeta potential of (Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES圖2 (Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES的Zeta電位

此外,還經DLS測定得知(Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES的水合粒徑為255.0 nm,相比于未被氨基硅烷修飾的(Fe3O4/R6G)@SiO2(1b)的水合粒徑(342.0 nm),其粒徑明顯減小,這可能也是由于氨基硅烷修飾的(Fe3O4/R6G)@SiO2表面帶有正電荷,因靜電排斥作用的存在減少了復合納米粒子的團聚,從而穩(wěn)定了復合納米粒子的緣故。

2.1.4 熒光譜圖

(a) (Fe3O4/R6G)@SiO2, (b) (Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES dispersed in water (the concentration was 0.67 mg·mL-1)Fig.3 Fluorescence spectra(a)(Fe3O4/R6G)@SiO2,(b) (Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES(濃度均為0.67 mg·mL-1)圖3 熒光譜圖

分別將適量(Fe3O4/R6G)@SiO2和(Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES超聲分散于蒸餾水中,得到濃度為0.67 mg·mL-1的樣品分散液,將上述兩種分散液分別置于FluoroMax-4熒光光度計,固定激發(fā)波長480 nm進行譜圖掃描,掃描波長范圍為500～600 nm。由圖3可知,上述兩種復合納米粒子均在最大發(fā)射峰位于547 nm處出現(xiàn)較強的熒光發(fā)射峰,這與文獻中報道的R6G在水中的熒光發(fā)射峰位置一致[13],表明熒光染料R6G已被成功地包裹在熒光磁性復合納米粒子之中。此外,從圖3中亦可看到,(Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES的熒光強度明顯弱于(Fe3O4/R6G)@SiO2,這是由于進一步攪拌反應會降低R6G的包裹率所致。

2.2 氨基硅烷修飾的熒光磁性復合納米粒子對DNA的損傷情況

Lane 1: 3 μL DNA+7 μL buffer; Lane 2-6: 3 μLDNA+7 μL magnetic nanoparticles(concentration of the dispersion from left to right was 0.2, 0.5, 0.8, 1.2 and 1.5 mg·mL-1, respectively.)Fig.4 Electrophoresis analyses of DNA mixed with different concentrations of (Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES1:1:3 μL DNA+7 μL緩沖液;2-6:3 μL DNA+7 μL (Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES分散液(分散液濃度從左至右分別為0.2、0.5、0.8、1.2、1.5 mg·mL-1)圖4 熒光磁性復合納米粒子(Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES與DNA作用的凝膠電泳圖

由圖4可知,氨基硅烷修飾的熒光磁性復合納米粒子(Fe3O4/R6G)@SiO2-APTES幾乎不會對pBR322 DNA造成損傷,即使納米粒子的濃度達到1.5 mg·mL-1時,DNA的ccc泳帶沒有發(fā)生明顯變化。我們以前報道過檸檬酸修飾的磁性納米復合粒子(Fe3O4/CA)@SiO2有著很好的生物相容性[9],但當納米粒子的濃度達到0.33 mg·mL-1時,即會對DNA造成明顯的損傷,DNA的oc泳帶條紋亮度明顯增強,可見本文合成的氨基硅烷修飾的熒光磁性復合納米粒子要比(Fe3O4/CA)@SiO2具有更好的生物相容性。

3 結論

本文合成并表征了一種包裹熒光染料羅丹明6G的氨基硅烷修飾的熒光磁性復合納米粒子,初步探索了影響這類復合納米粒子粒徑的因素。這類納米粒子在水中具有很好的分散性和穩(wěn)定性,且有良好的生物相容性,有望成為一種新型抗癌藥物載體,值得進行深入研究。

致謝:本工作中所用到的Zetasizer Nano ZS型激光粒度儀由山西大學大型儀器中心提供。