田鼠巴貝斯蟲棒狀體蛋白相關(guān)因子1基因的原核表達及其特性研究

蔣藝佳，肖雯雯，聶 政，敖陽思琦，李慕曉，何 沛，周金林，趙俊龍，賀 蘭

（1.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，武漢 430070；2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

巴貝斯蟲病是由巴貝斯屬的多種巴貝斯蟲寄生于動物紅細胞內(nèi)引起的一種血液原蟲病，為人畜共患病[1]。該病主要通過硬蜱傳播，也可通過輸血傳播和胎盤傳播，其發(fā)生與流行具有明顯的季節(jié)性和地區(qū)性。發(fā)病的典型癥狀為高熱、溶血性貧血、黃疸、血紅蛋白尿等，嚴重可導致死亡。一般免疫正常的人感染巴貝斯蟲后無明顯臨床癥狀，但當其免疫力下降時，癥狀表現(xiàn)明顯，危害極大。

據(jù)文獻[2]報道，多種巴貝斯蟲具有人畜共患的能力，其中一種即為田鼠巴貝斯蟲（Babesia microti，B. microti）。1969年，美國東海岸報道了一例人的巴貝斯蟲病，其病原為田鼠巴貝斯蟲。此后相似病例相繼發(fā)生，在當?shù)匾饦O大轟動，隨后美國建立了專門研究田鼠巴貝斯蟲的實驗室；1977年，臺灣報道了嚙齒類巴貝斯蟲感染病例。同年，研究人員在幾位居民血清中檢驗出田鼠巴貝斯蟲抗體。近年來，田鼠巴貝斯感染人的相關(guān)病例逐漸增多[3]，引起人們的重視。

巴貝斯蟲的分子生物學研究表明，多種蛋白在蟲體感染機體的過程中發(fā)揮了重要的作用。GPI錨定裂殖子表面抗原（merozoite surface antigen，MSA）包裹在蟲體表面，從而有效地與靶細胞黏附，且編碼該抗原的表位基因片段存在大量多態(tài)性，可能與牛巴貝斯蟲的免疫逃避機制有關(guān)[4-6]；頂膜抗原1（apical membrane antigen-1，AMA1）是一種分泌到蟲體表面的蛋白，其中分歧巴貝斯蟲天然AMA1的蛋白水解產(chǎn)物可與紅細胞表面的相關(guān)受體結(jié)合，在蟲體入侵紅細胞的過程中發(fā)揮了重要的作用[7-8]；棒狀體相關(guān)蛋白1（rhoptry-associated protein1，RAP1）存在于所有的巴貝斯蟲種類中，且針對該蛋白的一些抗體可阻斷裂殖子的入侵，預示該蛋白可作為巴貝斯蟲免疫性保護的重要靶標[9-10]。

然而，目前對田鼠巴貝斯蟲的研究相對較少，對該病的診斷主要依賴于紅細胞染色鏡檢，存在染蟲率低及非急性感染診斷困難的問題。因此，建立檢測田鼠巴貝斯蟲血清學檢測方法極為重要。有研究表明，一種新型的田鼠巴貝斯蟲分泌蛋白（BmSA1）具有良好的診斷潛力[11]，但全長蛋白的表達量少，也不宜純化。因此，探索是否存在其他可作為田鼠巴貝斯蟲血清學檢測的候選分子極其有意義。

本實驗以田鼠巴貝斯蟲RAPIF1基因為研究對象，利用生物信息學分析軟件對其進行序列分析[12-13]，預測其親水性/疏水性、跨膜區(qū)、信號肽、翻譯后修飾位點、B淋巴細胞抗原表位等特性；并通過克隆載體與表達載體的構(gòu)建[14-15]，對其進行基因克隆與原核表達；運用SDS-PAGE、Western blot等方法檢測其免疫反應原性，評價RAPIF1是否具有成為田鼠巴貝斯蟲診斷和疫苗制備候選分子的可能。

1 材料與方法

1.1 蟲株、菌株、載體、實驗動物、主要試劑 田鼠巴貝斯蟲（Babesia microti，B. microti）PRA-99株由本實驗室提供，液氮保存；田鼠巴貝斯蟲陽性血清由人工感染實驗制備，保存于-20℃；Balb/c小鼠、昆明鼠購于華中農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心；大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α、BL21由本實驗室制備，-80℃保存；克隆載體pEASY-Blunt、表達載體pET-28a(+)購于北京氏金生物技術(shù)有限公司，-20℃保存；限制性內(nèi)切酶BamH 1、Xho1、TaqDNA聚合酶、dNTPs購自寶生生物工程（大連）有限公司，-20℃保存。氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、二硫蘇糖醇（DTT）、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）購自Amresco公司；牛血清白蛋白（BSA）、咪唑、考馬斯亮藍R250購自Biosharp公司；弗氏完全與不完全佐劑購自Sigma公司；預染與非預染蛋白Marker購自Thermo公司；血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；DNA膠回收試劑盒、DNA分子量標準、His-tag鎳親和層析介質(zhì)（ProteinPure Ni-NTA Resin）購自北京全氏金生物技術(shù)有限公司；蛋白濃度測定試劑盒、HRP標記羊抗鼠IgG購自江蘇南通碧云天生物科技研究所；LB液體培養(yǎng)基由本實驗室制備，高壓蒸汽滅菌后備用；其他各類試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 DNA模板的提取與DNA回收 根據(jù)田鼠巴貝斯蟲RAPIF1基因的核苷酸序列（GenBank登錄號：XP_012647190.1），利用Clone Manager 8軟件設計1對特異性引物，上游引物：5'-ATGGGCCTTTCTGATAATCTG- 3'，下游引物：5'-TTAACAGCCAATGCAACCAG- 3'。引物由上海生工生物工程有限公司合成。用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取田鼠巴貝斯蟲gDNA，擴增其開放閱讀框。用DNA膠回收試劑盒回收目的片段。具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.3 RAPIF1基因的原核表達 根據(jù)同源重組原理，利用Clone Manager 8軟件設計RAPIF1的特異性引物，上游引物：5'-GCAAATGGGTCGCGGATCCA TGGGCCTTTCTGATAATCTGTGC-3'，下游引物：5'-GGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTAACAGCCA ATGCAACCAGC-3'。引物由上海生工生物工程有限公司合成。用特異性引物和KD酶擴增RAPIF1，膠回收擴增產(chǎn)物。將回收產(chǎn)物與表達載體pET-28α相連接后。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，37℃振蕩培養(yǎng)1 h，涂布在含有卡那霉素平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取平板上的單菌落，PCR鑒定，篩選陽性克隆。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21，同樣篩選陽性克隆。將陽性克隆菌振蕩培養(yǎng)3 h，使菌處于對數(shù)生長期，加入誘導劑IPTG 0.8 mmol/L，28℃振蕩培養(yǎng)12 h，誘導其表達重組蛋白。同時設置陰性對照。取1.5 mL菌液，8000 ×g離心3 min，去上清；用40 μL ddH2O重懸沉淀；加50 μL 2% SDS上樣緩沖液，加10 μL DTT（二硫蘇糖醇）；沸水浴10 min，冰浴5 min。每孔上樣10 μL，跑膠；考馬斯亮藍染色液染色2 h，脫色液脫色至條帶清晰可見。

1.4 重組蛋白的純化 將誘導表達的菌液，在4℃的條件下，集菌，用壓力破碎儀破碎3次，12 000×g離心10 min，分離上清與包涵體，將上清經(jīng)過濾器過濾后與鎳柱結(jié)合2 h，然后分別用5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%咪唑洗脫。處理不同濃度咪唑的洗脫物，SDSPAGE電泳，收集洗脫蛋白，于PBS溶液中透析48 h，用蔗糖濃縮。

1.5 多克隆抗體的制備 在免疫昆明鼠前，采血獲陰性血清。將濃度為0.5 mg/mL的rRAPIF1與佐劑1∶1混合乳化，皮下注射免疫昆明鼠，每次免疫的rRAPIF1量為50 μg。分別于免疫后的0、14、28 d進行一免、二免和三免，三免后間隔10 d加強免疫一次，加強免疫后7 d收集鼠血清，經(jīng)純化獲得多克隆抗體。

1.6 Western blot 處理純化的重組蛋白與全蟲抗原樣品，SDS-PAGE電泳，將3層濾紙、凝膠、NC膜、3層濾紙按順序疊放在電轉(zhuǎn)儀陰極石墨板中央，電壓最大值，電流1.0 mA/cm2大小 ，穩(wěn)流電轉(zhuǎn)2 h。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，用5%脫脂奶4℃封閉過夜，TBST洗膜，3 min洗3次，5 min洗5次。加入用TBST 1∶400稀釋的血清，室溫孵育2 h，洗膜。加入用TBST 1∶10 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG，室溫避光孵育1 h，同上洗膜。用Odyssey CLx（紅外激光成像儀）照膠。

2 結(jié)果

2.1 基因克隆與鑒定 利用設計的特異性引物從田鼠巴貝斯蟲基因組中擴增出771 bp的目的片段（圖1）。將該片段與克隆載體pEASY-Blunt連接，轉(zhuǎn)化克隆后，挑取陽性克隆用BamH1/Xho1雙酶切鑒定：兩個片段大小分別為852、3848 bp（圖1）。目的片段的序列與田鼠巴貝斯蟲基因組數(shù)據(jù)庫的RAPIF1基因序列比對結(jié)果顯示，序列一致性為100%。

2.2 序列分析

2.2.1 基本理化性質(zhì) 利用ExPASy-ProtParam工具分析可知，RAPIF1基因編碼256個aa（圖2），分子質(zhì)量為29 kDa，等電點為5.09，在水中280 nm處的摩爾消光系數(shù)為27 305 mol/cm。該蛋白分子式是C1289H2068N340O403S11，富含纈氨酸、谷氨酸、賴氨酸、異亮氨酸等，其中纈氨酸占比13.7%。在體外哺乳動物網(wǎng)織紅細胞內(nèi)的半衰期為30 h，體外酵母菌內(nèi)的半衰期＞20 h，體外大腸桿菌內(nèi)的半衰期＞10 h，不穩(wěn)定系數(shù)為39.25，可認為其屬于穩(wěn)定蛋白。脂肪指數(shù)為89.26，親水性平均系數(shù)為-0.409，為親水性蛋白。

2.2.2 親水性/疏水性 利用ExPASy-ProtScale、Kyte&Doolittle分析可知，該蛋白含有多個親水區(qū)，分別位于氨基酸序列位點8～54、82～89、124～132、146～207、240～250（圖3A），結(jié)合其親水性平均系數(shù)為-0.409，可進一步證明其為親水性蛋白。

2.2.3 跨膜區(qū) 跨膜區(qū)的主要作用是把膜蛋白固定在細胞膜上，因此分析蛋白質(zhì)是否含有跨膜區(qū)，對其定位與定性具有指示意義。利用TMHMM隱馬爾科夫模型分析顯示，該蛋白無跨膜區(qū)，預測其不是跨膜蛋白（圖3B）。

圖1 RAPIF1基因的PCR擴增與pEASY-Blunt- RAPIF1重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.1 PCR amplification results of RAPIF1 gene and identification of pEASY-Blunt-RAPIF1 recombinant plasmid with restrictive enzyme digestion

2.2.4 信號肽 利用SignalP 4.1 server對蛋白的信號肽進行預測，C-score為信號肽剪切位點分值，S-score為信號肽位點分值，Y-score為綜合位點剪切分值。結(jié)果顯示，C-score、S-score、Y-score三值波動幅度較小，且無突出Y-score的最大值，判斷該蛋白無信號肽（圖3C）。

2.2.5 翻譯后修飾位點預測 利用Motif scan對該蛋白的修飾性位點進行預測，結(jié)果顯示，序列中存在酪蛋白激酶2磷酸化位點3個，N-?；稽c1個，蛋白激酶c磷酸化位點4個，N-糖基化位點1個（表1）。

2.2.6 B淋巴細胞抗原表位分析 B細胞表位通常能被宿主免疫系統(tǒng)識別，刺激機體產(chǎn)生特異性免疫。為進步探究其作為疫苗或者診斷分子的可能性，利用DNASTAR對RAPIF1潛在B細胞的表位進行預測。結(jié)果顯示，RAPIF1存在7個主要的B淋巴細胞抗原表位，其氨基酸序列位點分別為23～26、39～46、127～131、152～155、168～174、203～207和245～249（表2、圖4）。

2.3 原核表達與純化 將重組表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，對挑取的單菌落進行菌液PCR鑒定。將鑒定驗證為陽性的重組質(zhì)粒pET-28a-RAPIF1轉(zhuǎn)入E.coliBL21中誘導表達，表達產(chǎn)物命名為rRAPIF1。SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示，誘導樣品在37 kDa處條帶明顯增粗（圖5）。根據(jù)RAPIF1大小為29 kDa，pET-28a重組載體表達的His標簽大小為8 kDa可知，rRAPIF1大小與理論預測值相符。純化rRAPIF1蛋白電泳結(jié)果顯示清晰的單一條帶，大小為37 kDa，見圖5。

圖2 RAPIF1的開放閱讀框核苷酸與氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and amino acid sequences of RAPIF1 ORF

2.4 反應原性鑒定 rRAPIF1分別與田鼠巴貝斯蟲陽性血清和陰性血清與之反應，結(jié)果顯示陽性血清與重組蛋白在37 kDa處有單一的反應條帶，而陰性血清無任何條帶（圖6），表明該重組抗原可有效區(qū)分田鼠巴貝斯蟲陰性陽性血清，具有良好的反應原性。用田鼠巴貝斯蟲全蟲抗原，分別與RAPIF1的多克隆抗體和鼠陰性血清反應，結(jié)果顯示僅多克隆抗體與全蟲抗原29 kDa處顯示單一的條帶（圖6），表明RAPIF1存在于蟲體中。

圖3 RAPIF1的特性分析Fig.3 Analysis of RAPIF1

表1 RAPIF1的功能性位點預測Table 1 Post-translational modification(PTM)sites of the putative RAPIF1

表2 RAPIF1的B淋巴細胞抗原表位氨基酸序列Table 2 Potential B cell antigen epitopes position and sequences

圖4 RAPIF1的B淋巴細胞抗原表位分析Fig.4 Potential B cell antigen epitopes prediction of RAPIF1

圖5 rRAPIF1的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of rRAPIF1

圖6 rRAPIF1的Western blot 分析Fig.6 Western blot analysis of rRAPIF1

3 討論

棒狀體相關(guān)蛋白1（RAP1）存在于所有巴貝斯蟲中，在蟲體入侵過程中起到重要作用，且針對該蛋白的一些抗體可阻斷或抑制蟲體入侵[16]。因此，RAP1的功能研究、特異性疫苗制備與靶向藥物篩選是預防與治療巴貝斯蟲病的一個重要方向。根據(jù)其他一些巴貝斯蟲入侵相關(guān)因子[17-18]，如GPI錨定裂殖子表面抗原（MSA）、頂膜抗原1（AMA1）、凝血酶敏感素相關(guān)無名蛋白（TRAP）[19]、硫氧還蛋白（Trx）與硫氧還蛋白還原酶（Trx R）[20]等在蟲體入侵過程中發(fā)揮的重要作用，這些分子極有可能成為巴貝斯蟲免疫性保護的重要靶標。

然而，目前田鼠巴貝斯蟲病的相關(guān)研究及成果仍相對較少，主要集中在蟲體侵襲過程中一些較為明確的重要抗原上，對其他一些未知因子的研究尚不清楚或深入。因此，在本研究中，我們將目光投向田鼠巴貝斯蟲棒狀體蛋白相關(guān)因子1（RAPIF1），探索RAPIF1是否具有類似于RAP1的免疫特性，在蟲體感染過程中發(fā)揮重要的作用。

本研究根據(jù)已報道的田鼠巴貝斯蟲基因組數(shù)據(jù)庫，設計特異性引物，成功擴增到RAPIF1基因，其全長771 bp，編碼256 aa。利用多種生物信息學分析軟件對RAPIF1的基本理化性質(zhì)、親水性/疏水性、跨膜區(qū)、信號肽、翻譯后修飾位點及B淋巴細胞抗原表位等進行預測[21]，該蛋白為親水性蛋白，無跨膜區(qū)與信號肽，有較豐富的修飾性位點與B淋巴細胞抗原表位。

本實驗在獲得田鼠巴貝斯RAPIF1的cDNA（全長771 bp）的基礎上，將RAPIF1插入表達載體pET-28a中，并在大腸桿菌BL21中成功地表達了重組蛋白rRAPIF1。rRAPIF1在上清和包涵體中均有表達，且以上清表達形式為主。本研究利用His鎳柱純化重組蛋白，獲得了純度較高的蛋白。免疫印跡分析表明，rRAPIF1與田鼠巴貝斯蟲陽性血清反應，說明該蛋白具有良好的反應原性，免疫后的多克隆抗體可與全蟲抗原反應，說明RAPIF1存在于蟲體中，RAPIF1預期可作為田鼠巴貝斯蟲疫苗制備的候選抗原。