鎖陽(yáng)含藥血清對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖分化及礦化的影響

武海燕，張靈莉，馮雪梅

鎖陽(yáng)，性甘，溫，歸肝，腎，大腸經(jīng)。具有補(bǔ)腎陽(yáng)，益精血，潤(rùn)腸通便的作用?？捎糜谥委熌I陽(yáng)不足，精血虧虛，腰膝痿軟，陽(yáng)痿滑精，腸燥便秘等病癥[1]。明代《本草綱目》記載:“鎖陽(yáng)性溫，補(bǔ)腎，益精血，潤(rùn)燥養(yǎng)精治痿弱”?！侗静菰肌? “鎖陽(yáng)補(bǔ)陰血，祛虛火，興陽(yáng)固精，強(qiáng)陽(yáng)易髓”。《中藥志》:“補(bǔ)腎，滑腸，強(qiáng)腰膝，主治男子陽(yáng)痿。”現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鎖陽(yáng)含有含有糖和糖苷類、黃酮類、萜類、甾體類等多種化學(xué)成分，具有增強(qiáng)性功能、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗氧化等藥理作用[2～3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞加入鎖陽(yáng)含藥血清進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)成骨作用的影響，為鎖陽(yáng)與骨形成發(fā)育的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體重18～22 g 的SPF級(jí)昆明小鼠64只，（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(川)2015-030）雌雄各半，隨機(jī)分為四組，每組16只，分別為生理鹽水對(duì)照組，鎖陽(yáng)含藥血清低、中、高劑量組。

1.2 藥物及其制備

本實(shí)驗(yàn)所用中藥鎖陽(yáng)購(gòu)自同仁堂大藥房。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)藥物高劑量組濃度設(shè)置為0.9 g．mL-1。稱取90 g鎖陽(yáng)，煎至100 mL，使其最終藥物濃度為0.9 g．mL-1，此為高劑量組藥物濃度，采取倍比稀釋法分別稀釋適量為0.45、0.225 g．mL-1，分別為中劑量組與低劑量組灌胃濃度。

1.3 主要試劑與儀器

CCK8試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：#L21114)，堿性磷酸酶(ALP)染色試劑盒(南京建成科技有限公司，批號(hào)：20180124)，0.2%茜素紅染色試劑盒(北京Solarbio公司，批號(hào)：20171127)，倒置相差顯微鏡(日本 Olympus,型號(hào)：CK40-F200)，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(上海睿鈺生物科技有限公司，型號(hào)：IC1000)，二氧化碳培養(yǎng)箱(日本SANYO，型號(hào)：MCO-15AC)，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：Varioskan),超凈工作臺(tái)(蘇州凈化廠，型號(hào)：SWCJ-2F)。

1.4 方法

1.4.1 含藥血清制備 根據(jù)每只小鼠體重分別灌胃各組小鼠相應(yīng)濃度的鎖陽(yáng)水煎液(0.1 mL/10 g)，每天一次，連續(xù)灌胃兩周(14天)，并于最后一次灌胃2h后摘眼球取血，靜置半小時(shí)，3500 rpm．min-1離心15min后立即于超凈工作臺(tái)中操作，將同組血清混合，過(guò)0.22 μm濾膜除菌后于56℃恒溫水浴鍋中補(bǔ)體滅活30 min，將每組血清各自分裝為1mL/支，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 成骨細(xì)胞來(lái)源與培養(yǎng)…成骨細(xì)胞株MC3T3-E1Subclone 14來(lái)源于小鼠顱頂前成骨細(xì)胞亞克隆14，細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清，1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)基。細(xì)胞長(zhǎng)滿至瓶底80%時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，PBS沖洗后用胰酶消化至變圓時(shí)，立刻加入等量培養(yǎng)基終止消化，并根據(jù)細(xì)胞情況按合適的傳代比例進(jìn)行傳代。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)分組 將成骨細(xì)胞分為四組，分別為生理鹽水血清組，鎖陽(yáng)含藥血清低劑量組，含藥血清中劑量組及含藥血清高劑量組，每組的培養(yǎng)基中分別含有10%對(duì)應(yīng)組血清，不含胎牛血清，生理鹽水血清組培養(yǎng)基為含10%灌胃生理鹽水小鼠的血清。

1.4.4 成骨細(xì)胞增殖檢測(cè)…取生長(zhǎng)情況良好的第三代成骨細(xì)胞，以2×103個(gè)/100 μL每孔的細(xì)胞密度接種于96孔板，每組平行設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，24h后換為分別含10%濃度的鎖陽(yáng)含藥血清低、中、高劑量的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)成骨細(xì)胞，對(duì)照組則換為含10%生理鹽水組血清的培養(yǎng)液。分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后棄去舊培養(yǎng)液，每孔加100 μL不含血清的α-MEM培養(yǎng)基、10 μLCCK8試劑， 37℃、含5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)其OD值。

1.4.5 成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性檢測(cè)…取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成骨細(xì)胞以5×103 個(gè)/100 μL/孔的細(xì)胞密度接種于12孔板中，每組平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，24 h后將培養(yǎng)液換為不同濃度的鎖陽(yáng)含藥血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)照組加等量生理鹽水組血清，期間每隔兩天換液一次，培養(yǎng)七天后進(jìn)行鈣鈷法染色，并于倒置顯微鏡下觀察染色結(jié)果，測(cè)定其成骨細(xì)胞的ALP活性。

1.4.6 成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)染色…取長(zhǎng)勢(shì)良好的成骨細(xì)胞用胰酶消化后，以5×103 個(gè)/500 μL/孔的細(xì)胞密度鋪12板，每組平行設(shè)置三復(fù)孔，24 h后更換終濃度為含10 mM的β-甘油磷酸鈉與50 mg．L-1抗壞血酸的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，以后每隔2～3天換液一次，換液時(shí)動(dòng)作要輕柔，避免細(xì)胞脫離瓶底。連續(xù)培養(yǎng)14天后進(jìn)行茜素紅染色，觀察染色結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用單因素方差分析法(ANOVA)，組間比較采用t檢驗(yàn)，以p＜0.01為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞增殖情況(CCK8法)

在24，48，72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，鎖陽(yáng)含藥血清各組增殖均高于生理鹽水血清組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜ 0.05)。其中鎖陽(yáng)含藥血清中劑量組與高劑量組在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的增殖程度與生理鹽水血清組相比，差異均具有顯著性意義(P ＜ 0.01)；而鎖陽(yáng)含藥血清低劑量組在48 h，72 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)與生理鹽水血清組比較，差異不具有顯著性意義。(P ＞0.01) (Fig.1)

Fig.1鎖陽(yáng)含藥血清對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖的影響(x±s,n=6)

2.2 成骨細(xì)胞ALP活性檢測(cè)(鈣鈷法)

鈣鈷法染色后，胞質(zhì)中陽(yáng)性反應(yīng)呈現(xiàn)灰黑色顆?；驂K狀、條狀沉淀。如圖示，成骨細(xì)胞分泌ALP的含量隨著鎖陽(yáng)含藥血清濃度增加呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，而生理鹽水血清組分泌的ALP明顯少于藥物血清組。(圖2)

圖2 不同濃度鎖陽(yáng)含藥血清對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶染色結(jié)果(10×20)

2.3 成骨細(xì)胞茜素紅染色

經(jīng)0.2%茜素紅染液染色后，鈣沉積物呈橙紅色。如圖示，鎖陽(yáng)含藥血清高劑量組的鈣化結(jié)節(jié)較其他兩組更多，分布更加廣泛。而生理鹽水血清組的鈣化結(jié)節(jié)顏色較淺，數(shù)量最少。(圖3)

圖3 不同濃度鎖陽(yáng)含藥血清對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞茜素紅染色(10×20)

3 討論

鎖陽(yáng)是一味傳統(tǒng)補(bǔ)腎中藥，具有補(bǔ)腎陽(yáng)，益精血的作用。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎主骨生髓，故認(rèn)為補(bǔ)腎類中藥與骨的形成發(fā)育或骨類疾病有密切的關(guān)系。張霞等[4]發(fā)現(xiàn)，鎖陽(yáng)80%乙醇提取物可以對(duì)去卵巢致大鼠的骨質(zhì)疏松產(chǎn)生明顯的預(yù)防作用；史平等[5]發(fā)現(xiàn)，40 mg．kg-1的鎖陽(yáng)多糖可逆轉(zhuǎn)血清BGP及尿液DPD含量，其類雌激素樣作用使其具有防治骨質(zhì)疏松的作用；馮方[6]用鎖陽(yáng)提取液干預(yù)激素性股骨頭壞死兔模型8周后，發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)股骨頭壞死情況的好轉(zhuǎn)；本實(shí)驗(yàn)通過(guò)鎖陽(yáng)含藥血清干預(yù)成骨細(xì)胞，旨在從成骨細(xì)胞角度觀察鎖陽(yáng)與骨形成發(fā)育的相關(guān)性。

MC3T3-E1是來(lái)源于小鼠顱頂?shù)某晒羌?xì)胞株，其與體內(nèi)成骨活性很相似，在抗壞血酸和3-4mM無(wú)機(jī)磷酸鹽中生長(zhǎng)表現(xiàn)出高水平的細(xì)胞分化，是研究成骨細(xì)胞很好的細(xì)胞模型[7～8]。本實(shí)驗(yàn)采用操作更簡(jiǎn)便，更精確的CCK8法[9]檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)在24，48，72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與生理鹽水血清組比較，鎖陽(yáng)含藥血清組能夠不同程度的促進(jìn)MC3T3-E1的增殖，且有一定的濃度依賴性，鎖陽(yáng)含藥血清濃度越高，細(xì)胞增殖越多。

成骨細(xì)胞富含堿性磷酸酶(ALP)，其是主要分布于細(xì)胞膜的鈣結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有促進(jìn)細(xì)胞成熟、鈣化的作用，其活性可作為評(píng)價(jià)成骨細(xì)胞分化程度的良好指標(biāo)[10]。成骨細(xì)胞有體外礦化特征，礦化結(jié)節(jié)形成是成骨細(xì)胞骨形成功能的表現(xiàn)[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的鎖陽(yáng)含藥血清能夠不同程度的促進(jìn)體外成骨細(xì)胞增殖分化以及礦化，且在一定濃度范圍內(nèi)，濃度越高，促進(jìn)作用越明顯，提示鎖陽(yáng)可能通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化與鈣化干預(yù)骨形成。

補(bǔ)腎中藥主要通過(guò)BMP-Smads、Wnt/β-catenin等信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的作用，進(jìn)而促進(jìn)骨形成過(guò)程[12]。Zhang JF等[13]發(fā)現(xiàn)，淫羊藿可通過(guò)BMP和Wnt /β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)成骨分化起促進(jìn)作用，Tang DZ等[14]證明補(bǔ)骨脂素可上調(diào)BMP2和BMP4基因表達(dá)量，增加BMP報(bào)告基因12xSBE-OC-Luc的活性，同時(shí)增強(qiáng)了BMP信號(hào)傳導(dǎo)的直接靶基因Osx的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)初步觀察得到鎖陽(yáng)含藥血清可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，具體經(jīng)由BMP信號(hào)通路還是Wnt/β-catenin等其他信號(hào)通路途徑發(fā)揮作用，還需進(jìn)一步研究。