兔p38MAPK基因沉默腺病毒載體構(gòu)建及體外干擾效率的鑒定*

全 鋼，賈鎧寧，于 果，許堯祥，岳 金，肖文林△

(1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第四師醫(yī)院口腔頜面外科，新疆伊寧 835000； 2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科/青島大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院/青島大學(xué)附屬醫(yī)院山東省教育廳口腔重點實驗室，山東青島 266555)

盡管唇裂修復(fù)術(shù)手術(shù)縫線不斷更新、術(shù)式不斷改良，但是唇裂術(shù)后瘢痕甚至瘢痕的增生不僅影響患者面部的美觀，甚至對患者的心理造成不良影響?；蛑委熡糜诟纳苽谛迯?fù)方面是一個新的概念，其為從根本上防治瘢痕的增生性病變提供了可能。如果不針對特定的因子突變位點進行基因敲除，可能引起皮膚正常發(fā)育紊亂甚至動物死亡。因此，研究傷口愈合的理想模型是于局部傷口中應(yīng)用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)使某種基因敲除或過表達，來觀察其對傷口修復(fù)機制的影響。鑒于以往的實驗研究結(jié)果可知，腺病毒是針對皮膚瘢痕進行基因治療的理想載體。本實驗的目的是構(gòu)建p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)基因沉默病毒載體，為唇裂術(shù)后瘢痕增生的基因治療提供理論支持。

表1 p38MAPK的shRNA序列

F:正向；R:反向

1 材料與方法

1.1材料 (1)動物：新西蘭兔64只，購自青島康大生物科技有限公司。(2)儀器與試劑：冷凍高速離心機購自美國Thermo fisher公司，DNA電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，M199液體培養(yǎng)基購自美國Sigma公司，T4 DNA Ligase、Pst Ⅰ、BamH Ⅰ購自美國NEB公司，胎牛血清(Gibco)、HEK293A細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞庫，DH5a感受態(tài)細胞、小量質(zhì)粒抽提試劑盒、Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker購自北京全式金生物公司，DNA測序購自上海生工生物公司，腺病毒干擾載體質(zhì)粒購自北京歐林格生物公司， shRNA片段合成購自南京金斯瑞生物公司，Qiagen大規(guī)模質(zhì)粒抽提試劑盒購自德國Qiagen公司，pDC316-ZsGreen-ShRNA腺病毒試劑盒購自美國Biovector公司。

1.2方法

1.2.1pDC316-ZsGreen-ShRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建 利用p38MAPK序列cDNA文庫設(shè)計shRNA序列，經(jīng)Blast表明其與小鼠其它cDNA序列不同源，合成3條含干擾序列的雙鏈DNA oligo。根據(jù)p38MAPK序列設(shè)計shRNA，合成3個shRNA片段，合成序列見表1。DNA片段經(jīng)由退火緩沖液完全退火后，3對片段分別用T4連接酶將其與pDC316-shRNA-ZsGreen連接起來。將10 μL過夜連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100 μL感受態(tài)細胞，涂于含氨芐西林的LB培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。在5 mL，100 μg/mL Ampicillin抗性的LB培養(yǎng)液中分別挑取1個單菌落接種培養(yǎng)，250 r/min，37 ℃恒溫搖床培養(yǎng)過夜。隨后抽提質(zhì)粒，分別用BamHⅠ和EcoRⅠ做酶切鑒定。構(gòu)建的3組重組質(zhì)粒分別命名為pDC316-ZsGreen-ShRNA-1、2、3。

1.2.2AD-shRNA-p38MAPK腺病毒病毒包裝 將HEK293A細胞種在面積為10 cm2培養(yǎng)皿中，傳代培養(yǎng)。使用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細胞密度后重新接種于6孔板中。用500 μL無血清稀釋培養(yǎng)基對4 μg pDC316-ZsGreen-ShRNA重組質(zhì)粒、10 μg Pshutter-CMV、10 μg pAdenoviral vector稀釋，充分混勻。加入30 μL Lipofectamine3000脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染，室溫靜置20 min。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入HEK293A細胞培養(yǎng)皿中。第2天利用完全培養(yǎng)基對去除含DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物進行培養(yǎng)，48～72 h可產(chǎn)生大量病毒。對病毒進行收集，使用0.45 μm濾器進行過濾4 ℃、10 000 r/min超速離心2 h后棄上清液，沉淀物為p38MAPK基因RNAi腺病毒載體將沉淀下的載體分裝后，保存于-80 ℃冰箱。將腺病毒載體分為3組，分別為AD-shRNA-p38MAPK-1、AD-shRNA-p38MAPK-2、AD-shRNA-p38MAPK-3。將純化的病毒倍比稀釋后轉(zhuǎn)染HEK293A細胞，48 h熒光顯微鏡觀察熒光；稀釋病毒上清液的體積均為107μL。將HEK293A細胞放于12孔培養(yǎng)板中，混勻后培養(yǎng)于37 ℃ CO2孵箱。24 h后添加100 μL完全培養(yǎng)基。4 d后觀察熒光表達情況。隨著稀釋倍數(shù)的增加，熒光細胞數(shù)減少。換算公式：滴度(TU/mL)=熒光細胞個數(shù)/病毒原液量

1.2.3分離培養(yǎng)兔皮膚成纖維細胞 用水合氯醛將新西蘭兔麻醉后俯臥位固定，乙醇棉球消毒脫毛區(qū)后切取約2 cm×3 cm的皮膚。放于250 U/mL雙抗生理鹽水中浸泡滅菌30 min，而后刮去皮下脂肪等。用PBS洗滌數(shù)遍，剪成約1 mm3左右的皮片。常溫下用混合酶消化45 min，持續(xù)振蕩。細胞沉淀重懸后接種培養(yǎng)。棄培養(yǎng)基，先用PBS洗1遍，而后加入1～2 mL胰酶，消化。1 000 r/min離心3 min，棄上清液，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代。

1.2.4實時熒光定量PCR(real-time PCR)檢測腺病毒感染皮膚成纖維細胞后p38MAPK的干擾效率 調(diào)整細胞密度而后重新接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，細胞貼壁后感染。感染前2 h換液。按照每孔感染復(fù)數(shù)(MOI)=1∶5比例加入病毒。感染48 h后，參照說明書進行反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測。每一標本分別放入3個復(fù)孔中，得出每組的Ct值，從而計算出每組的相對表達水平。所有實驗重復(fù)3次。RT-PCR檢測的目的基因引物序列的正義鏈：5′-GGG ACC TAA AGC CTA GTA AC-3′；反義鏈：5′-CGA CCG ACC AAA TAT CAA-3′。內(nèi)參β-actin引物序列正義鏈：5′-TGG CTC TAA CAA GTC CGC CTA G-3′；反義鏈：5′-AGT GCG ACG TGG ACA TCC G-3′。

2 結(jié) 果

2.1重組質(zhì)粒的酶切鑒定及測序結(jié)果 將重組質(zhì)粒分別以BamHⅠ和EcoRⅠ做酶切鑒定，鑒定酶切圖譜見圖1。挑取酶切鑒定正確的陽性菌測序，測序峰圖見圖2。酶切鑒定結(jié)果及測序結(jié)果說明，3個pDC316-shRNA-ZsGreen質(zhì)粒均完全符合設(shè)計要求。

M：Marker;1、2、3：構(gòu)建的質(zhì)粒；4：空白對照組

圖1重組質(zhì)粒PCR酶切鑒定圖

2.2轉(zhuǎn)染后HEK293A的細胞效應(yīng) pDC316-ZsGreen-shRNA-p38MAPK-1、pDC316-ZsGreen-shRNA-p38MAPK-2、pDC316-ZsGreen-shRNA-p38MAPK-3載體分別共轉(zhuǎn)染HEK293A細胞后，HEK293A細胞變圓，部分融合，出現(xiàn)多核復(fù)合體，見圖3。

2.3兔皮膚成纖維細胞分離培養(yǎng) 顯微鏡下，原代兔上唇皮膚成纖維細胞，大致呈梭形或紡錘形，見圖4。

2.4real-time PCR檢測腺病毒感染目的細胞后p38MAPK的干擾效率 校準基因為管家基因β-actin作為空白對照組，兔上唇成纖維細胞p38MAPK mRNA的相對表達水平定為1；所有標本重復(fù)3次，計算-△△ct，以平均相對表達水平為2-△△Ct計算其他各病毒轉(zhuǎn)染組兔上唇成纖維細胞p38MAPK 的 mRNA的相對表達水平。與空白對照組比較，各組p38MAPK mRNA相對表達水平均有不同降低，其中AD-shRNA-p38MAPK-1組的p38MAPK的mRNA表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

1、2、3：重組質(zhì)粒pDC316-ZsGreen-shRNA-p38MAPK-1、2、3；4：重組質(zhì)粒NC組

圖2 p38MAPK干擾序列測序結(jié)果圖

圖3 pDC316-ZsGreen-shRNA-p38MAPK轉(zhuǎn)染后293T細胞出現(xiàn)細胞病理效應(yīng)(×200)

圖4 培養(yǎng)的兔上唇成纖維細胞(×400)

1:AD-shRNA-p38MAPK-1組；2:AD-shRNA-p38MAPK-2組；3:AD-shRNA-p38MAPK-3組；4:pDC316-ZsGreen-shRNA-scramble組；5:空白對照組；a:P<0.05，與AD-shRNA-p38MAPK比較

圖5 p38MAPK腺病毒轉(zhuǎn)染后的各組細胞mRNA相對表達水平

3 討 論

傷口的愈合分為兩種：一種是由與受損傷部位特性相同的細胞修復(fù)即完全性修復(fù)，常見于表淺傷口的正常愈合及胎兒傷口無瘢痕愈合；另一種是幾乎所有傷口愈合的結(jié)局，即上皮化的同時瘢痕形成。傷口收縮是加速傷口愈合的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但是過度的收縮則會導(dǎo)致傷口攣縮的發(fā)生，嚴重影響機體的功能和美觀。但目前尚未發(fā)現(xiàn)可以抑制瘢痕形成的方法。

MAPKs是細胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細胞內(nèi)，p38MAPK是其一個亞家族，是MAPK信號傳導(dǎo)通路一種經(jīng)典途徑[1-2]。其參與調(diào)控細胞生長、發(fā)育、分裂，并在傷口愈合中發(fā)揮作用。有研究表明，瘢痕成纖維細胞的分化依賴于α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)及機械力的參與[3]。陳偉等[4]研究發(fā)現(xiàn)MKK3、MKK6和p38MAPK基因表達在早期妊娠胎兒的皮膚組織中表達較強。隨著胎齡的增加，其表達逐漸減弱，其基因表達的變化與傷口愈合形成瘢痕的過程相一致。從而發(fā)現(xiàn)MKK3、MKK6和p38MAPK基因高表達可能是早期妊娠胎兒皮膚傷口無瘢痕愈合的原因。杜啟翠等[5]的研究表明，p38MAPK阻斷劑可以減少成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，減少α-SMA和TGF-β1的表達，從而可以防止皮膚瘢痕的形成。這些研究均表明在傷口的愈合中p38MAPK信號通路可能起著舉足輕重的作用，同時其之間的關(guān)系還有待進一步的研究。

基因治療是指將外源正?；?qū)胧荏w細胞，以糾正或補償基因缺陷和異常引起的疾病，以達到治療疾病的目的，可基因治療最初被認為只是一種治療先天性代謝功能缺陷或晚期惡性腫瘤患者的方式[6]?；蚩赏ㄟ^體內(nèi)或體外的方法進行轉(zhuǎn)導(dǎo)。載體的選擇對于基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)十分關(guān)鍵[7-9]。目前,基因治療中基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方式有兩種，分別是病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和非病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。病毒的基因轉(zhuǎn)染的效率明顯偏高。病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的創(chuàng)傷基因治療的理想模型具有高效性、自限性、靶向性、少或無毒副作用及特異性。腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒為最常用的病毒載體。腺病毒是目前瞬時基因轉(zhuǎn)導(dǎo)最有效的載體，因其廣泛的細胞趨向性，可以作為不同組織的良好指示劑。反轉(zhuǎn)錄病毒載體具有能夠整合入宿主細胞基因組的優(yōu)點，因此具有實現(xiàn)缺陷基因的終生校正的潛力。使用反轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點是轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低，因為載體需要轉(zhuǎn)染分裂細胞，并且在體內(nèi)不穩(wěn)定[10]。研究已表明皮膚細胞轉(zhuǎn)染效率高達95%，皮膚轉(zhuǎn)染模型安全性較高。因此，人類腺病毒是基因治療中最常見的病毒載體。STITELMAN等[11]的研究表明，腺病毒介導(dǎo)的血小板源性生長因子β(PDGF-β)的基因轉(zhuǎn)移克服了傷口愈合中的缺血缺陷，并對于治療慢性非愈合性傷口提供了希望，其病毒的衣殼蛋白作用可能是腺病毒引起急性炎性反應(yīng)的原因。皮膚是腺病毒介導(dǎo)的基因治療的理想靶器官[12-13]。ARAGONA等[14]的研究表明,在小鼠皮膚上腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染基因可高效表達。免疫反應(yīng)導(dǎo)致的炎癥是腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)中對傷口愈合最大的影響，而SYLVESTER等[15]的文獻表明，盡管腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后的小鼠模型皮膚傷口出可能引發(fā)急性炎性反應(yīng),但并未最終影響受傷皮膚的愈合能力。

成纖維細胞是皮膚疏松結(jié)締組織中的重要細胞，也是瘢痕形成過程中的重要細胞。瘢痕是在傷口愈合過程中，肌成纖維細胞形成，從而使創(chuàng)口收縮而形成的。現(xiàn)在已有成熟的成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞的細胞培養(yǎng)技術(shù)，基因檢測技術(shù)更加成熟[16]。

本實驗取新西蘭白兔上唇皮膚，成功培養(yǎng)出成纖維細胞，將構(gòu)建的病毒載體可以成功轉(zhuǎn)染到皮膚成纖維細胞中，并運用此細胞篩選出沉默效率最高的一個腺病毒載體，為其能在活體局部注射后取得良好的沉默效果奠定了基礎(chǔ)。