PPAR-α受體激動(dòng)劑對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用*

楊旭堃,申 芹

(四川大學(xué)華西第四醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室，成都 610041)

肝臟部分切除在臨床上被廣泛用于治療肝臟外傷、肝臟腫瘤、肝臟內(nèi)膽管結(jié)石等疾病。此外，肝移植還是目前治療終末期肝臟疾病惟一的有效治療方式。 肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury，HI/R)嚴(yán)重制約了肝移植及肝臟切除術(shù)的廣泛開(kāi)展[1]。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明。既往研究顯示，再灌注過(guò)程中引起的線粒體凋亡途徑廣泛激活是導(dǎo)致缺血再灌注損傷的重要因素[1]。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α,PPAR-α) 是由配體激活的在肝臟廣泛表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)控脂肪肝等多種肝臟疾病的發(fā)病過(guò)程，但對(duì)缺血再灌注損傷的作用尚不清楚[2]。為此，本實(shí)驗(yàn)在成功構(gòu)建大鼠HI/R模型的基礎(chǔ)上，觀察PPAR-α激動(dòng)劑非諾貝特(fenofibrate,FEN)對(duì)HI/R的影響，并初步探討其在HI/R中的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只健康雄性SPF級(jí)SD大鼠,體質(zhì)量(220±30)g,購(gòu)于四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2主要試劑 PPAR-α激活劑FEN購(gòu)自北京京豐制藥有限公司，PPAR-α抑制劑GW6471購(gòu)自天津彬馨博澳有限公司;水合氯醛購(gòu)自武漢谷歌科技有限公司；沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silence information regulator 1,SIRT1)、叉頭轉(zhuǎn)錄因子1(forkhead transcription factor1，F(xiàn)OXO1)、乙酰化FOXO1(Ace-FOXO1)、裂解型天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved-caspase3,C-caspase3)和細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C(cytochrome C,CytC)、Bax均購(gòu)自美國(guó)CST公司；β-actin購(gòu)自美國(guó)Abgent公司；TUNEL 試劑盒購(gòu)買于北京中生有限公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及建模 根據(jù)OHMORI等[3]方法構(gòu)建大鼠HI/R模型。按4 mg/kg的10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,取上腹部正中切口進(jìn)入腹腔,充分暴露肝門部,利用無(wú)創(chuàng)血管夾鉗夾閉門靜脈和肝動(dòng)脈分枝,誘發(fā)70%的熱缺血,60 min后松開(kāi)血管鉗恢復(fù)肝臟血流即行再灌注,120 min肝臟再灌注完成后從門靜脈取血2～3 mL,并迅速切取缺血的肝組織,置于-80 ℃低溫冰箱保存，具體手術(shù)方式參照文獻(xiàn)[4]。將40只SD大鼠均分為對(duì)照組、模型組、PPAR-α激動(dòng)劑FEN組(FEN組)和PPAR-α抑制劑GW6471組(GW組)，每組10只。FEN組術(shù)前1 h給予FEN腹腔注射(50 mg/kg)，GW組術(shù)前1 h給予FEN (50 mg/kg)+GW6471(3.5 mg/kg)腹腔注射,劑量參考文獻(xiàn)[5]。對(duì)照組和模型組則給予等量生理鹽水腹腔注射。模型組、FEN組和GW組行HI/R損傷，對(duì)照組操作同上，但不夾閉門靜脈和肝動(dòng)脈分枝。

1.2.2標(biāo)本檢測(cè) 在再灌注后2 h從門靜脈抽取靜脈血,利用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)水平。收取各組肝臟標(biāo)本,采用TUNEL法檢測(cè)肝臟細(xì)胞凋亡，利用蘇木精-尹紅(HE) 染色觀察各組肝臟組織病理形態(tài)。利用Western blot檢測(cè)SIRT1、FOXO1、Ace-FOXO1、C-caspase3和細(xì)胞質(zhì)中CytC表達(dá)水平，具體方法參考文獻(xiàn)[6]。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血清中ALT、AST和ALP水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST和ALP水平明顯升高(P<0.01);經(jīng)FEN預(yù)處理，F(xiàn)EN組HI/R大鼠血清中ALT、AST 和ALP水平較模型組明顯降低(P<0.05)；而GW組與FEN組比較，HI/R大鼠血清中ALT、AST 和ALP水平明顯增高(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

1：對(duì)照組；2：模型組；3：FEN組；4：GW組；a：P<0.01，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與FEN組比較

圖1各組大鼠血清中ALT、AST和ALP水平比較

2.2各組大鼠肝臟病理形態(tài)結(jié)構(gòu)比較 對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，模型組肝細(xì)胞大范圍出血壞死，匯管區(qū)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)中央靜脈，與對(duì)照組比較，病理?yè)p傷明顯增加(P<0.05)；FEN組肝細(xì)胞水腫變性，未見(jiàn)壞死，散在空泡樣變，匯管區(qū)可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，與模型組比較，F(xiàn)EN組病理?yè)p傷明顯減輕(P<0.05) ；GW組可見(jiàn)肝細(xì)胞廣泛腫脹、空泡樣變、壞死，匯管區(qū)可見(jiàn)較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，與FEN組比較，病理?yè)p傷明顯增加(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

a：P<0.01，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與FEN組比較

圖2各組大鼠肝臟組織病理改變(HE，×200)

2.3各組大鼠肝臟TNUEL表達(dá)比較 與對(duì)照組比較,模型組TUNEL陽(yáng)性表達(dá)率明顯增高(P<0.05)； FEN組與模型組相比，TUNEL陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低(P<0.05)；GW組與FEN組比較，TUNEL陽(yáng)性表達(dá)率明顯增高(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

a：P<0.01，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與FEN組比較

圖3各組大鼠肝臟細(xì)胞凋亡情況(TUNEL，×100)

2.4各組大鼠肝臟C-caspase3表達(dá)水平比較 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組C-caspase3表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)； FEN組與模型組比較，C-caspase3表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與FEN組比較,GW組C-caspase3表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

2.5各組大鼠肝臟細(xì)胞質(zhì)中CytC表達(dá)水平比較 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞質(zhì)CytC表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)； FEN組與模型組比較，細(xì)胞質(zhì)CytC表達(dá)明顯降低(P<0.05)，與FEN組比較,GW組細(xì)胞質(zhì)中CytC表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

a：P<0.01，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與FEN組比較

圖4各組大鼠肝臟C-caspase3蛋白表達(dá)水平比較

a：P<0.01，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與FEN組比較

圖5各組大鼠肝臟細(xì)胞質(zhì)中CytC蛋白表達(dá)水平比較

2.6FEN對(duì)HI/R大鼠肝臟SIRT1/FOXO1信號(hào)通路的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較,模型組SIRT1蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),而Ace-FOXO1蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)，F(xiàn)OXO1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較,FEN組SIRT1蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.05),而Ace-FOXO1蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，F(xiàn)OXO1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與FEN組比較,GW組SIRT1蛋白表達(dá)水平明顯降低 (P<0.05),而Ace-FOXO1蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)，F(xiàn)OXO1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖6。

1：對(duì)照組；2：模型組；3：FEN組；4：GW組；a：P<0.01，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與FEN組比較

圖6各組大鼠SIRT1及Ace-FOXO1等蛋白

表達(dá)水平比較

3 討 論

缺血性肝損傷是臨床上常見(jiàn)的肝臟疾病之一，其誘發(fā)的肝臟功能受損乃至肝臟功能衰竭發(fā)生率較高[1-2]。肝臟缺血發(fā)生后，及時(shí)恢復(fù)缺血區(qū)肝臟血流是減少肝臟受損最有效的治療方案，但缺血肝組織恢復(fù)肝臟血流灌注后，伴隨大量活性氧產(chǎn)生，繼而導(dǎo)致肝臟細(xì)胞凋亡和壞死加重，這種臨床現(xiàn)象稱之為HI/R[1-2]。目前對(duì)HI/R的防治手段極其有限，因此，尋找有效治療藥物具有緊迫而重大的臨床現(xiàn)實(shí)意義。

FEN是PPAR-α激動(dòng)劑之一，在臨床上廣泛用于降血脂[3]。研究顯示，PPAR-α激動(dòng)劑FEN除具有降脂的活性外，還具有抗氧化、抗癌、抗炎及抗凋亡等多種生物學(xué)活性[3]。最近研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-α激動(dòng)劑對(duì)心、腸、腎等器官缺血損傷具有保護(hù)作用，但對(duì)HI/R的作用及機(jī)制尚不清楚[7]。此外，PPAR-α特異性阻斷劑，如GW6471可反轉(zhuǎn)PPAR-α激動(dòng)劑對(duì)器官缺血損傷的保護(hù)作用[8]。因此本研究擬探討PPAR-α激動(dòng)劑非諾貝特對(duì)HI/R的保護(hù)作用及其相關(guān)作用機(jī)制。

在OHMORI等[3]構(gòu)建的經(jīng)典HI/R模型中，HI/R可導(dǎo)致大鼠肝功嚴(yán)重受損和肝臟病理改變。本研究結(jié)果顯示HI/R可導(dǎo)致血清中急性肝損傷指標(biāo)如ALT、AST和ALP表達(dá)水平增高及肝臟病理形態(tài)改變，與OHMORI等[3]的研究結(jié)果一致，提示本研究構(gòu)建大鼠HI/R模型成功。而PPAR-α激動(dòng)劑FEN預(yù)處理可明顯減少ALT、AST和ALP表達(dá)水平，而肝臟病理?yè)p傷及PPAR-α特異性阻斷劑GW6471可反轉(zhuǎn)FEN的上述作用，提示PPAR-α激動(dòng)劑對(duì)HI/R保護(hù)作用，其作用機(jī)制與激活PPAR-α相關(guān)。

細(xì)胞凋亡是受基因嚴(yán)密控制的程序化細(xì)胞死亡，是細(xì)胞死亡的一種重要形式，是可反映機(jī)體器官受損的一個(gè)重要指標(biāo)[9]。既往研究顯示，線粒體介導(dǎo)的肝臟細(xì)胞凋亡是HI/R的重要致病機(jī)制[1]。caspase9是線粒體凋亡途徑中的啟動(dòng)子及重要關(guān)聯(lián)蛋白[10]。當(dāng)線粒體凋亡途徑被缺血再灌注損傷激活時(shí)，位于線粒體中的CytC遷徙到細(xì)胞質(zhì)，與線粒體凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)等形成凋亡體。該凋亡體可與caspase9結(jié)合，在ATP的作用下，可促進(jìn)caspase9轉(zhuǎn)化為活化的caspase9,然后活化的caspase9可呈級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)caspase3降解和C-caspase3表達(dá)增高,然后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。因此C-caspase3、TUNEL及細(xì)胞質(zhì)中CytC表達(dá)的高低可反映線粒體介導(dǎo)凋亡信號(hào)途徑的強(qiáng)弱。結(jié)果顯示，與GW組和模型組相比，F(xiàn)EN組C-caspase3、TUNEL及細(xì)胞質(zhì)中CytC表達(dá)明顯降低，提示PPAR-α激動(dòng)劑FEN可通過(guò)抑制線粒體凋亡信號(hào)途徑激活減輕HI/R。

SIRT1是一組蛋白脫乙酰化修飾酶，其活性主要依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，大量研究顯示其具有調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、分化、凋亡和抗衰老及減輕HI/R的重要作用，其轉(zhuǎn)錄底物包括FOXO1,p53和Ku70等[12]。本課題組既往研究顯示，其抗凋亡的信號(hào)途徑為促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子FOXO1去乙?；?，繼而減少線粒體凋亡信號(hào)途徑的激活和細(xì)胞凋亡[12]。本研究結(jié)果顯示，與GW組和模型組相比，F(xiàn)EN組SIRT1表達(dá)增高，而Ace-FOXO1的表達(dá)降低。提示PPAR-α激動(dòng)劑FEN可通過(guò)增加SIRT1的表達(dá)而減少FOXO1的乙?；揎?，從而抑制線粒體凋亡途徑的激活。

綜上所述，PPAR-α激動(dòng)劑FEN對(duì)HI/R具有保護(hù)作用，而SIRT1/FOXO1 信號(hào)通路抑制線粒體介導(dǎo)的凋亡信號(hào)途徑在其肝臟保護(hù)作用中起重要作用，該研究為臨床上應(yīng)用PPAR-α激動(dòng)劑治療缺血性肝損傷患者提供了新的理論依據(jù)。