白質(zhì)纖維束磁共振擴散張量成像在恒河猴腦梗死模型中的應用

姚添奇 張默 何小奪 陳健 吳迪 丁玉川

腦梗死是一種致殘率和致死率較高的腦血管疾病，腦白質(zhì)纖維束損傷是腦梗死主要表現(xiàn)之一，與患者的臨床預后密切相關。MR功能成像技術(shù)能夠較早期地評估腦白質(zhì)損傷。擴散張量成像(diffusion tensor imaging，DTI)是評價腦白質(zhì)纖維束的影像學新技術(shù),其在臨床中屬于水彌漫成像技術(shù)，主要是對人體水分子的彌散定量來直接反映人腦深部灰質(zhì)及白質(zhì)發(fā)生的微結(jié)構(gòu)變化[1]。DTI是從多個方向獲取擴散加權(quán)圖像,得到每一個體素的擴散張量的成像過程。DTI作為非侵入性的分析大腦內(nèi)部結(jié)構(gòu)的重要工具，是唯一能夠進行活體測量神經(jīng)纖維的成像技術(shù)。DTI技術(shù)不僅能夠動態(tài)跟蹤患者腦白質(zhì)纖維變化，還能夠?qū)⒒颊吣X部發(fā)生病變部位對其腦白質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響展示出來[2]。恒河猴與人類的許多生物學特性(腦部結(jié)構(gòu)、灰白質(zhì)組成、血管分布等)接近，因此恒河猴腦缺血模型是轉(zhuǎn)化醫(yī)學的重要方法[3]。本研究采用中國科學院自動化研究所開發(fā)的DiffusionKit軟件，應用MR DTI動態(tài)評估恒河猴局部腦缺血模型的白質(zhì)纖維變化，通過自身比較，評估非人靈長類動物模型局部腦缺血后白質(zhì)纖維束的損傷及修復過程[4]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年雄性恒河猴4只，清潔級，年齡分別為8.0、8.5、9.5、6.0歲，平均(8.0±1.5)歲；體質(zhì)量為11.0、10.2、8.6、8.5 kg,平均(9.6±1.2) kg，由解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供[合格證號：SCXK(軍)2012-0019][5]。動物日常喂養(yǎng)在首都醫(yī)科大學實驗動物室[SYXK(京)2014-0018]，每只動物均單獨飼養(yǎng)，喂養(yǎng)1個月以上后用于實驗。所用實驗動物經(jīng)檢測排除結(jié)核分枝桿菌、志賀菌、沙門菌、寄生蟲、B病毒等感染。實驗方案經(jīng)首都醫(yī)科大學動物倫理委員會批準(倫理號：AEEI-2016-174)。

1.2 主要試劑與儀器

麻醉藥品：丙泊酚(10 ml/100 mg，批號：320040,AstraZeneca UK Limited)；氯胺酮(2 ml/0.1 g，批號：111207，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；速眠新(批號：201403，廣州萊綠寵商貿(mào)有限公司)。實驗所用磁共振設備為德國Simens公司生產(chǎn)的Verio 3.0 T超導磁共振掃描儀，搭配使用Simens 32通道頭部線圈；其他器材包括微導絲(Traxcess 14，美國)、Rebar18 微導管(Micro Therapeutics，美國)。

1.3 實驗方法

模型動物術(shù)前8 h禁水，2 h禁食，對實驗動物的生命體征全程監(jiān)測，手術(shù)臺通過電熱毯輔助加熱，動物肛溫控制在37 ℃，肌內(nèi)注射氯胺酮(2 ml)+速眠新(1 ml)誘導麻醉，丙泊酚0.3～0.4 mg/(kg·h)持續(xù)靜脈滴注麻醉。采用冠狀動脈造影并應用5 F動脈鞘組穿刺針、導引鋼絲、動脈鞘行經(jīng)皮穿刺股動脈。在0.889 mm(0.035英寸)超滑導絲引導下，將5 F導引導管置入右側(cè)頸內(nèi)動脈，退出導絲造影。然后通過微導絲將微導管頭送達右側(cè)大腦中動脈M1段，撤導絲，將一根10 cm自體血栓送至M1段，閉塞2.5 h后給予重組組織型纖溶酶原激活劑溶栓治療。手術(shù)過程中對體溫、血壓、心率、呼吸、血氧持續(xù)監(jiān)測。結(jié)束后對穿刺點加壓包扎，待恢復自主呼吸后，送至磁共振室進行腦成像檢查，檢查結(jié)束送回動物房，給予甘露醇等對癥治療以及保暖、營養(yǎng)等支持[6]。

1.4 掃描序列與參數(shù)

分別于腦缺血后4 h、7 d、30 d進行MR掃描，掃描時采用頭部固定裝置擺正頭部位置，以前聯(lián)合與后聯(lián)合連線為中心線進行掃描?；緟?shù)：重復時間(repetition time，TR)、回波時間(echo time,TE)、視野(field of view，F(xiàn)OV)。常規(guī)掃描序列：(1)T1加權(quán)三維磁化強度預備梯度回波序列，TR=1 900 ms,TE=2.99 ms,FOV=230 mm×230 mm；(2)T2加權(quán)成像,TR=4 000 ms,TE=100 ms,FOV=180 mm×180 mm；(3)T2 MR液體衰減反轉(zhuǎn)恢復序列,TR=9 000 ms,TE=96 ms,FOV=220 mm×220 mm；(4)時間飛躍-MR血管成像,TR=20 ms,TE=3.6 ms,FOV=220 mm×220 mm；(5)擴散加權(quán)成像,TR=6 000 ms,TE=100 ms,FOV=220 mm×220 mm；(6)DTI,TR=9 000 ms,TE=92 ms,FOV=131 mm×131 mm。

1.5 后處理方法

纖維束示蹤成像軟件為中國科學院自動化研究所開發(fā)的DiffusionKit軟件[4]。將獲得的DICOM圖像在DiffusionKit軟件上進行圖像預處理(a：格式轉(zhuǎn)換；b：渦流矯正；c：頭骨剝離)、圖像配準、重組、纖維束成像、可視化。通過冠狀面圖像的內(nèi)囊層面，左右內(nèi)囊白質(zhì)處選定感興趣區(qū)，感興趣區(qū)采用統(tǒng)一的半徑，通過感興趣區(qū)來追蹤纖維束，可視化之后可以看到纖維束走向和纖維束數(shù)量。測量病灶內(nèi)的各向異性分數(shù)(fractional anisotropy,FA)值并與健側(cè)對比，同時選擇病灶側(cè)和對側(cè)的額葉和小腦評估FA值和纖維束數(shù)量。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

圖1顯示，注射血栓后恒河猴大腦中動脈M1段閉塞，經(jīng)局部動脈溶栓治療后，M1段實現(xiàn)血管再通。對于梗死灶側(cè)(右側(cè))和對側(cè)(左側(cè))，以及額葉、小腦區(qū)域的FA動態(tài)分析顯示，梗死灶側(cè)(右側(cè))腦缺血后4 h、7 d、30 d FA比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=8.565，P<0.05)，其中梗死灶區(qū)缺血后7 d FA低于缺血后4 h(P=0.04) 和30 d(P=0.043)的FA。梗死灶對側(cè)(左側(cè))、額葉(右側(cè)和左側(cè))及小腦(右側(cè)和左側(cè))FA動態(tài)比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表1。

對梗死灶側(cè)(右側(cè))和對側(cè)(左側(cè))以及額葉、小腦區(qū)域的纖維束數(shù)量動態(tài)分析結(jié)果顯示，僅梗死灶側(cè)(右側(cè))纖維束數(shù)量動態(tài)比較，差異具有統(tǒng)計學意義(F=10.658,P<0.05)，其中梗死灶區(qū)缺血后7 d纖維束數(shù)量低于缺血后4 h(P=0.045)和30 d (P=0.033)的纖維束數(shù)量。梗死灶對側(cè)(左側(cè))、額葉(右側(cè)和左側(cè))及小腦(右側(cè)和左側(cè))的纖維束數(shù)量動態(tài)比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表2。

表1 大腦中動脈閉塞-再通恒河猴模型腦缺血后4 h、7 d、30 d不同腦區(qū)各向異性分數(shù)的變化

表2 大腦中動脈閉塞-再通恒河猴模型腦缺血后4 h、7 d、30 d不同腦區(qū)纖維束數(shù)量的變化

3 討論

DTI是能在活體狀態(tài)下顯示白質(zhì)纖維束走向的成像技術(shù)，在臨床與科研方面有重要價值，可顯示纖維束形態(tài)變化與梗死灶的空間位置關系，可以結(jié)合臨床癥狀，指導患者的康復治療。DTI的基本原理是水分子在不均質(zhì)組織具有彌散各向異性的特征，在平行于纖維方向的彌散速度遠遠大于垂直方向的彌散速度，這種方向依賴性的彌散就是FA。FA是描述腦白質(zhì)纖維各向異性特征的主要參數(shù)之一，其大小與髓鞘的完整性、纖維致密性及平行性有密切關系，能夠反映白質(zhì)纖維束的完整性[7]。FA越大，神經(jīng)傳導功能越強。通過FA可以反映水分子彌散方向的強度，也可以通過白質(zhì)纖維束成像直觀反映組織的形態(tài)[8]。

在非人靈長類動物上制備局部腦缺血模型，并進行臨床相關的再通實驗，能夠完全模擬疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。非人靈長類動物在基因上接近人類，大腦解剖結(jié)構(gòu)、血管分布、灰質(zhì)和白質(zhì)的構(gòu)成與人類似，適合MRI檢查，尤其適合進行DTI研究[3]。因此，國際卒中圓桌會議特別推薦，神經(jīng)保護藥物在臨床試驗之前應以非人靈長類動物模型進行研究。大腦中動脈是腦缺血的好發(fā)部位，大多數(shù)模型均是針對大腦中動脈展開[9]。血管介入制備模型與腦梗死發(fā)病、治療過程非常相似。因此，標準化的DTI數(shù)據(jù)能夠為臨床研究提供準確的參照。

3.0 T MRI的DTI序列為腦梗死的科研和臨床應用提供了重要參照。DTI使用至少在6個方向的擴散梯度測定水分子的擴散。本研究采用64個方向擴散梯度的DTI，對恒河猴模型進行自身前后對照，并應用中國科學院自動化研究所開發(fā)的纖維束示蹤成像軟件DiffusionKit軟件對恒河猴局部腦缺血后的纖維束進行了動態(tài)分析。結(jié)果顯示，局部腦缺血后右側(cè)(缺血側(cè))梗死灶FA值和纖維束數(shù)量均呈現(xiàn)先降低再升高的趨勢，提示腦缺血急性期后腦白質(zhì)和纖維束逐步恢復。

近年來隨著取栓治療的開展，血管再通率顯著提高，相關腦保護研究陸續(xù)開展[10]。采用多種核磁程序序列，包括DTI，將為臨床轉(zhuǎn)化研究提供更多療效評估的工具，非人靈長類動物模型也將更多地被應用于腦保護研究中。