HCG日不同優(yōu)勢卵泡比例對IVF/ICSI妊娠結(jié)局的影響

林海燕，李 予，張清學(xué)，李 軼

（中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東廣州510120）

輔助生育技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）技術(shù)發(fā)展至今，人絨毛膜促性腺激素（human chroionic gonadotophin，HCG）日注射外源性HCG促卵子最后成熟（即“扳機”）是重要的步驟。一直以來HCG注射時機尚未有完全一致標(biāo)準(zhǔn)。臨床上以陰道B超監(jiān)測出現(xiàn)至少2～3個主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm或3個直徑≥17 mm時可考慮注射HCG（即HCG日）［1］。促排卵方案中除長方案之外，拮抗劑方案也因其獨特的安全性優(yōu)勢，明顯降低卵巢過度刺激綜合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）發(fā)生率，其應(yīng)用漸增多。拮抗劑方案進入臨床十余年，其臨床妊娠率卻一直低于長方案。有學(xué)者提出拮抗劑方案的學(xué)習(xí)曲線包括了扳機時機的重新學(xué)習(xí)，將已經(jīng)習(xí)慣的長方案的扳機標(biāo)準(zhǔn)放入拮抗劑方案中是不合適的。有的學(xué)者認(rèn)為推遲HCG注射時間可改善結(jié)局；也有學(xué)者提出不同意見，拮抗劑方案中HCG扳機時機不應(yīng)該推遲，否則影響臨床妊娠率［2-4］，甚至需要比長方案更嚴(yán)格從而提出提早注射HCG。由于患者個體間卵巢儲備不一，HCG日優(yōu)勢卵泡比例更能反映個體間的差異。經(jīng)典的長方案以較好的卵泡同步發(fā)育為特點，保證了穩(wěn)定的臨床妊娠率，而拮抗劑方案利用卵泡發(fā)育不同步在卵巢高儲備患者促排中占有優(yōu)勢，明顯降低OHSS發(fā)生率［5］。為了解HCG日優(yōu)勢卵泡比例在不同方案、不同年齡群中對ART結(jié)局的影響，我們通過回顧性分析病例資料，分層分組比較不同年齡段、不同方案間不同HCG日不同優(yōu)勢卵泡比例助孕結(jié)局的影響，旨在尋找適合不同年齡段、不同方案的HCG扳機標(biāo)準(zhǔn)，為控制性促排卵的個體化治療提供臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2014年1月至2016年12月在中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院生殖中心行長方案或拮抗劑方案體外受精-胚胎移植/單精子卵泡漿內(nèi)顯微注射（IVF/ICSI）周期資料，納入標(biāo)準(zhǔn)：①女方年齡≥20歲以上；②具有IVF/ICSI指征，包括經(jīng)皮附睪或睪丸顯微取精術(shù)（PESA/TESA）周期；③長效長方案/短效長方案或者拮抗劑方案；④完成HCG日扳機患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：資料不完整。同時滿足以上納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，其中長效長方案/短效長方案IVF/ICSI共3 064周期，拮抗劑方案IVF/ICSI共918例。所有患者均已簽署知情同意書，回顧性研究項目已獲得醫(yī)院生殖倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 促排卵方案及分組情況

1.2.1 長方案或短效長方案IVF/ICSI 月經(jīng)周期的第18～22天（排卵后5～7 d）即黃體中期行陰道B超檢查見典型的黃體聲像，必要時測血孕酮水平≥5 μg/L，確定排卵后予以注射促性腺激素釋放激素激動劑（gonadotropin releasing hormone agonist，GnRHa）0.93～1.25 mg降調(diào)節(jié)（短效長方案中予以短效GnRHa 0.1 mg肌肉注射，每日1次直至HCG日），2周后行陰道B超檢查及血卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、雌二醇（estradiol，E2）檢查，達(dá)到完全降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)后（當(dāng)FSH＜5 U/L，LH＜5 U/L，E2＜50 pg/mL，子宮內(nèi)膜厚度＜6 mm時）予以促性腺激素（gonadotropin）每天100～300 U促排卵，每3～5 d監(jiān)測B超及血性激素了解卵泡發(fā)育情況，當(dāng)出現(xiàn)至少一個卵泡直徑大于等于18 mm或至少3個卵泡直徑大于等于17 mm可予以HCG 4 000～10 000 U扳機，36～38 h后行經(jīng)陰道取卵術(shù)，取卵后即行胚胎培養(yǎng)3～5 d行胚胎移植術(shù)，黃體支持從取卵日開始使用黃體酮注射液每天60 mg或者陰道用黃體酮膠囊每天600 mg直至驗孕日。

1.2.2 拮抗劑方案IVF/ICSI 月經(jīng)周期第2～3天抽血查性激素FSH、LH、E2，經(jīng)陰道B超了解雙側(cè)卵巢竇卵泡情況，即開始使用促性腺激素每天75～300 U促排卵，每3～5 d監(jiān)測B超及血性激素了解卵泡發(fā)育情況，當(dāng)出現(xiàn)至少一個卵泡直徑大于等于18 mm或至少3個卵泡直徑大于等于17 mm可予以HCG 4 000～10 000 U 扳機或GnRHa 0.1～0.2 mg扳機。36 h后在陰道B超引導(dǎo)下使用17 G取卵針經(jīng)陰道穿刺取卵術(shù)，取卵后即行胚胎培養(yǎng)3～5 d行胚胎移植術(shù)，黃體支持從取卵日開始使用黃體酮注射液60 mg/d或者陰道用黃體酮膠囊600 mg/d直至驗孕日。

1.3 治療結(jié)局及指標(biāo)

胚胎移植（Embryo Transfer，ET）后 12～14 d血HCG大于20 U/L診斷為生化妊娠，ET后34 d經(jīng)陰道B超見宮內(nèi)妊娠囊及早期心管搏動診斷為臨床妊娠?；颊呤紫纫阅挲g分為≤30歲年齡群和≥40歲年齡群，然后以HCG日優(yōu)勢卵泡比（proportion of dominant follicles，PDF）分組。HCG日優(yōu)勢卵泡比為HCG日直徑18 mm及以上卵泡數(shù)目/直徑10 mm及以上卵泡數(shù)目。優(yōu)勢卵泡比呈偏態(tài)分布，取百分比33%、67%分布界點作為分組標(biāo)準(zhǔn)。相對應(yīng)的取以優(yōu)勢卵泡比20%與40%分為3組。低比例組：優(yōu)勢卵泡比例＜20%；中比例組：優(yōu)勢卵泡比例20%～40%；高比例組：優(yōu)勢卵泡比例＞40%。各組間比較患者基本臨床資料包括年齡、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、不孕年限、竇卵泡數(shù)（antral follicle count，AFC）和基礎(chǔ)FSH等，還包括ART助孕資料，Gn啟動量、獲卵數(shù)、受精率、可利用胚胎率、臨床妊娠率和OHSS發(fā)生率等。其中臨床妊娠率為臨床妊娠周期/胚胎移植周期總數(shù)；可利用胚胎率為第3天胚胎形態(tài)學(xué)評分為4細(xì)胞Ⅱ級以上或第5天囊胚評分3級以上胚胎總數(shù)/獲卵數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0行統(tǒng)計學(xué)分析，使用one-sample K-S法對數(shù)據(jù)進行正態(tài)檢驗。對符合正態(tài)分布的計量資料進一步行方差齊性檢驗，方差齊的數(shù)據(jù)采用ANOVA方差分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；兩兩比較采用LSD及Tamhane法分析。對定性資料采用卡方檢驗，以百分率表示。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用對數(shù)法進行正態(tài)轉(zhuǎn)化后，行Logistic回歸分析，向前LR，觀察與臨床妊娠相關(guān)的指標(biāo)。均為雙側(cè)檢驗，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本資料比較

3組患者的基本臨床資料如年齡、BMI、AFC之間無統(tǒng)計學(xué)差異（表1、2）。

2.2 促排卵資料比較

≤30歲年齡群患者中使用長方案結(jié)果分析：促性腺激素（gonadotropin，Gn）總用量及啟動量均隨著HCG日優(yōu)勢卵泡比增加而增加（F=13.773，20.925，P ＜ 0.001；表1）。HCG日E2水平呈現(xiàn)隨著優(yōu)勢卵泡比增加而下降趨勢（F=14.977，P＜0.001；表1）。隨著HCG日18 mm以上卵泡數(shù)目增加，3組PDF增加，其他指標(biāo)包括Gn天數(shù)、HCG日孕酮（progesterone，P）3組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。使用拮抗劑方案結(jié)果分析：Gn總用量、啟動量及Gn天數(shù)在3組間無統(tǒng)計學(xué)差異，HCG日E2水平呈現(xiàn)隨著優(yōu)勢卵泡比增加而下降趨勢（F=4.974，P=0.007；表1）。隨著HCG日18 mm以上卵泡數(shù)目增加，3組PDF增加（表1）。

≥40歲年齡群患者中使用長方案結(jié)果分析：Gn總用量及啟動量在HCG日優(yōu)勢卵泡比＞40%組明顯高于另外2組（P ＜0.05；表2），HCG日優(yōu)勢卵泡比＜20%組HCG日E2水平明顯高于＞40%組（P＜0.05；表2）。隨著HCG日18 mm以上卵泡數(shù)目增加，3組PDF增加（P＜0.05；表2）。使用拮抗劑方案結(jié)果分析：Gn啟動量在HCG日優(yōu)勢卵泡比20%～40%組明顯高于另外2組，Gn總用量、HCG日E2水平等3組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。隨著HCG日18 mm以上卵泡數(shù)目增加，3組優(yōu)勢卵泡比增加（F=220.70，P ＜0.001；表2）。兩種方案中，其他指標(biāo)包括Gn天數(shù)、HCG日P等3組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（表2）。

2.3 胚胎培養(yǎng)及結(jié)局指標(biāo)比較

≤30歲年齡群患者中無論在長方案還是拮抗劑方案，獲卵數(shù)都隨著HCG日優(yōu)勢卵泡比增加而增加（P＜0.05；表3）。使用長方案結(jié)果分析：成熟卵子率在HCG日優(yōu)勢卵泡比＜20%組明顯低于另外2組（F=4.766，P ＜0.05；表3）。HCG日優(yōu)勢卵泡比＞40%組在卵裂率的比較上明顯低于另外2組（F=6.688，P ＜ 0.05；表3），臨床妊娠率比較3組間無統(tǒng)計學(xué)差異，中重度OHSS發(fā)生率并未隨HCG日優(yōu)勢卵泡比增加而增加。使用拮抗劑方案結(jié)果分析：成熟卵子率、卵裂率、正常受精率、異常受精率、可利用胚胎率在3種不同比例組均無統(tǒng)計學(xué)差異。臨床妊娠率、中重度OHSS發(fā)生率在3組間差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.236，P＞0.05；表3，圖1）。

表1 不同促排卵方案≤30歲患者臨床特征比較Table 1 Comparison of clinical characteristics of patients≤30 years among different

表1 不同促排卵方案≤30歲患者臨床特征比較Table 1 Comparison of clinical characteristics of patients≤30 years among different

BMI：body mass index；FSH：follicle-Stimulating Hormone；AFC：antral follicle count；Gn：Gonadotropin；E2：estradiol on the HCG day；P：progesterone on the HCG day；PDF：proportion of dominant follicles；A：low PDF；B：medium PDF；C：high PDF；1）：P＜0.05 vs.Group A；2）：P＜0.05 vs.Group B

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表2 不同促排卵方案≥40歲患者臨床特征比較Table 2 Comparison of clinical characteristics of patients≥40 years among different

表2 不同促排卵方案≥40歲患者臨床特征比較Table 2 Comparison of clinical characteristics of patients≥40 years among different

BMI：body mass index；FSH：follicle-Stimulating Hormone；AFC：antral follicle count；Gn：Gonadotropin；E2：estradiol on the HCG day；P：progesterone on the HCG day；PDF：proportion of dominant follicles；A：low PDF；B：medium PDF；C：high PDF；1）P＜0.05 vs.Group A；2）P＜0.05 vs.Group B.

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≥40歲年齡群患者中使用長方案結(jié)果分析：HCG日優(yōu)勢卵泡比＜20%組獲卵數(shù)明顯高于另外2組，可利用胚胎率最低（F=3.458，P ＜ 0.05；表4）。HCG日優(yōu)勢卵泡比＞40%組可利用胚胎率高，但臨床妊娠率（30.88%）低于另外2組（40%、42.04%），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。使用拮抗劑方案結(jié)果分析：獲卵數(shù)、成熟卵子率、受精率、正常受精率、異常受精率、卵裂率、可利用胚胎率在3組間均無統(tǒng)計學(xué)差異。臨床妊娠率在HCG日優(yōu)勢卵泡比＜20%組為27.27%，明顯高于另外2組（9.09%，7.40%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=21.413，P＜0.05；表4，圖1）。兩種方案中均無中重度OHSS發(fā)生。

表3 不同促排卵方案≤30歲患者IVF/ICSI助孕結(jié)局比較Table 3 Comparison of IVF/ICSI outcomes of patients≤30 years among different ，%（n）］

表3 不同促排卵方案≤30歲患者IVF/ICSI助孕結(jié)局比較Table 3 Comparison of IVF/ICSI outcomes of patients≤30 years among different ，%（n）］

A：low PDF；B：medium PDF；C：high PDF；1）P＜0.05 vs.Group A；2）P＜0.05 vs.Group B；3）χ2test was used.

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表4 不同促排卵方案≥40歲患者IVF/ICSI助孕結(jié)局比較Table 4 Comparison of IVF/ICSI outcomes of patients≥40 years among different protocols ，%（n）］

表4 不同促排卵方案≥40歲患者IVF/ICSI助孕結(jié)局比較Table 4 Comparison of IVF/ICSI outcomes of patients≥40 years among different protocols ，%（n）］

A：low PDF；B：medium PDF；C：high PDF；1）：P＜0.05 vs.Group A；3）χ2test was used.

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2.4 logistic回歸分析

長方案3 064個周期資料，采用二元回歸模型，以臨床妊娠作為因變量，代入女方年齡、AFC等多個指標(biāo)，結(jié)果顯示：女方年齡、Gn總量、AFC、HCG日P、PDF、成熟卵子率與臨床妊娠密切相關(guān)。而Gn天數(shù)及啟動量、HCG日E2、正常受精率等與臨床妊娠相關(guān)性不高（表5）。

圖1 ≤30歲患者長方案與拮抗劑方案中不同PDF臨床妊娠率比較Fig.1 Comparison of clinical pregnancy rate of age≤30 patients between different Protocols

拮抗劑方案918個周期資料，采用二元回歸模型，以臨床妊娠作為因變量，代入女方年齡、AFC等多個指標(biāo)，結(jié)果顯示：女方年齡、體質(zhì)量指數(shù)、Gn啟動量、正常卵裂率與與臨床妊娠密切相關(guān)（表6）。

表5 長方案中臨床妊娠相關(guān)因素Logistic回歸分析Table 5 Logistic regression analysis of factors related to clinical pregnancy in GnRHa long

表6 拮抗劑方案中臨床妊娠相關(guān)因素Logistic回歸分析Table 6 Logistic regression analysis of factors related to clinical pregnancy in GnRH antagonist protocol

3 討論

優(yōu)勢卵泡直徑達(dá)18～22 mm時提示卵泡成熟。在促排卵周期中需給予HCG誘發(fā)排卵，給藥時間需根據(jù)卵泡的成熟情況來確定，過早給予可導(dǎo)致卵泡閉鎖，過遲給予可造成卵泡過熟老化和子宮內(nèi)膜容受性下降。因此，HCG注射日優(yōu)勢卵泡18 mm以上卵泡比例與妊娠密切相關(guān)，對預(yù)測治療周期妊娠機會具有重要意義。大量研究證實從優(yōu)勢卵泡中獲得的卵子質(zhì)量優(yōu)于小卵泡［6］，因此大多數(shù)觀點傾向于從大卵泡獲取卵子易于形成優(yōu)質(zhì)的胚胎。獲得妊娠者優(yōu)勢卵泡直徑均在17～23 mm范圍內(nèi)，其中直徑為18～22 mm者占93.3%［7］。臨床現(xiàn)象中極大卵泡（直徑大于23 mm）獲卵率低，中等大小卵泡（直徑約12～16 mm）獲卵率高，仍有機會獲得優(yōu)質(zhì)胚胎［8］；傳統(tǒng)的方法根據(jù)HCG日17～18 mm以上卵泡數(shù)目1～3個即決定HCG注射時機，具有一定的片面性，年輕高卵巢儲備的患者與高齡低卵巢儲備的患者均以同一標(biāo)準(zhǔn)行HCG注射，后續(xù)的獲卵情況及妊娠結(jié)局卻可能截然不同。因為不同患者使用同一方案卵泡發(fā)育同步性可能不一，同時同一患者使用不同方案卵泡發(fā)育情況可能不一致，單純使用幾個成熟卵泡數(shù)量確定HCG注射時機不適合所有方案、所有患者，有必要探索個體化的HCG注射時機。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)高比例組卵子成熟率顯著增加［9］，但優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率及妊娠率反而有所下降，一定程度上說明卵泡徑線過大可能會對卵子質(zhì)量造成負(fù)面影響，一方面可能是卵泡已黃素化，顆粒細(xì)胞開始發(fā)生凋亡增加，卵子可能老化，另一方面可能是影響了子宮內(nèi)膜的容受性［10］。本研究在既往研究基礎(chǔ)上改良后使用HCG日優(yōu)勢卵泡≥18 mm卵泡數(shù)占直徑10 mm以上卵泡總數(shù)比例作為HCG注射的參考依據(jù)，研究在比例不同的情況下不同年齡段、不同方案下注射HCG時機與妊娠結(jié)局的關(guān)系，進一步探索最適合HCG注射的優(yōu)勢卵泡比例。

不同方案中扳機時機可能對妊娠結(jié)局有不同程度的影響。長方案在完全抑制下丘腦-垂體-卵巢軸（hypothalamus-pituitary-ovarian axis，HPO）軸的情況下盡可能使多的卵泡發(fā)育成熟，獲卵數(shù)與妊娠結(jié)局密切相關(guān)，推遲HCG注射將有更多的卵子可能成熟并被獲得［11］，發(fā)生黃素化幾率低，對內(nèi)膜容受影響小。拮抗劑方案對HPO軸影響小，通過外源性Gn促卵子發(fā)育，卵子發(fā)育同步性較長方案差，主導(dǎo)卵泡生長快，HCG注射時機可能影響獲卵數(shù)及后續(xù)胚胎發(fā)育。推遲HCG注射，成熟卵子率增加，但并不增加臨床妊娠率。曾有學(xué)者推測在拮抗劑方案周期中，卵泡的募集波有2波［12-13］，前一周期黃體晚期卵泡募集波和月經(jīng)周期卵泡早期卵泡募集波，可以體現(xiàn)在卵泡早期陰道B超上，卵泡大小不一。月經(jīng)周期第3天開始使用外源性Gn，這兩波卵泡均生長，但前一募集波卵泡更早進入優(yōu)勢卵泡群，后一募集波卵泡大小處于中等，于是出現(xiàn)了HCG注射時機的抉擇問題。已有研究表明包括黃體期促排方案的證據(jù)均提示兩波募集波獲得的卵子質(zhì)量或胚胎質(zhì)量可能存在差異［14］。有研究提示在拮抗劑方案中增加成熟卵泡比例臨床結(jié)局更好［15］。本研究結(jié)果提示增加優(yōu)勢卵泡比例在年輕患者不同年齡段患者中對臨床結(jié)局影響小，但在高齡患者中增加優(yōu)勢卵泡比例，臨床妊娠率明顯降低。Logistic回歸分析結(jié)果也提示PDF在常規(guī)方案中與年齡同時影響臨床妊娠的重要因素。我們推測年輕患者大多卵巢儲備好，卵子發(fā)育受外界影響小，自我修復(fù)能力強［16］；高齡患者卵巢儲備差，卵子發(fā)育較易受外界影響，自我修復(fù)能力差。

2014年我們首次提出使用HCG日成熟卵泡比例（≥18 mm以上卵泡數(shù)/卵泡總數(shù)）研究不同比例下注射HCG對卵子發(fā)育及妊娠結(jié)局的影響。由于HCG日卵泡總數(shù)包括一些小卵泡如10 mm以下卵泡具有較大的個體差異、方案差異性，為了能更好的優(yōu)化優(yōu)勢卵泡比例這一指標(biāo)，我們此次回顧性分析大樣本的臨床資料，旨在初步探索合適的優(yōu)勢卵泡比例指導(dǎo)臨床決策。雖然在基線資料上有少數(shù)指標(biāo)出現(xiàn)組間統(tǒng)計學(xué)差異，限于本研究是回顧性研究，存在多種混雜因素和偏倚。但年齡作為臨床妊娠率的獨立影響因素，在組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。再加上回歸分析結(jié)果，有理由相信本文分析的結(jié)論是有較大信服力的。HCG日優(yōu)勢卵泡比可以反映卵泡發(fā)育的同步性，推遲HCG注射可使成熟卵子率增加，但可能出現(xiàn)孕酮的提早升高，子宮內(nèi)膜容受性受影響。合適的HCG日優(yōu)勢卵泡比，可使合適數(shù)量的卵子，達(dá)到細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核的同步成熟，優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)目多，保證了妊娠結(jié)局。既往有學(xué)者曾提出FORT（卵泡輸出率）的概念［17-19］，在我們看來HCG日優(yōu)勢卵泡的數(shù)量及質(zhì)量才是影響ART結(jié)局的關(guān)鍵因素。目前相關(guān)的研究極少，如何抓住特定人群如PCOS、高齡等人群特點利用HCG日優(yōu)勢卵泡比保證患者預(yù)后，是本研究的目的之一。在年輕（≤30歲）的患者中，年齡與卵子質(zhì)量均較好，無論長方案或拮抗劑方案，隨著HCG日優(yōu)勢卵泡比增加可能影響成熟卵子率，但不影響臨床結(jié)局。而在高齡（≥40歲）患者中，年齡大卵子質(zhì)量不佳，無論長方案或拮抗劑方案，HCG日優(yōu)勢卵泡比例＞40%，臨床妊娠率明顯降低，在拮抗劑方案中將優(yōu)勢卵泡比例控制在20%以內(nèi)更重要。

總結(jié)，HCG注射時機是控制性超排卵中重要的環(huán)節(jié)，個體化的把握注射時機對患者個體的臨床妊娠結(jié)局產(chǎn)生重要的影響。與傳統(tǒng)方法不同，本研究通過引入優(yōu)勢卵泡比例在大樣本中比較不同年齡段、不同方案間比例的選擇決定HCG注射時機，為控制性超促排卵個體化治療提供了依據(jù)。