鈣熒光白和熒光刀豆蛋白A標(biāo)記的白念珠菌生長活性和粘附能力

張 靜，吳曉雁，黃家敏，陸 春，黃懷球

（中山大學(xué)1.附屬第三醫(yī)院皮膚性病科，廣東 廣州 510630；2.孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院皮膚性病科，廣東 廣州 510120）

白念珠菌是系統(tǒng)性念珠菌病的主要致病真菌。鈣熒光白（calcofluor white，CFW）和熒光刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）分別結(jié)合白念珠菌細(xì)胞壁上的幾丁質(zhì)和甘露聚糖，使白念珠菌細(xì)胞壁著色，可用于白念珠菌幾丁質(zhì)和甘露聚糖的半定量、幾丁質(zhì)和甘露聚糖在細(xì)胞壁的分布、白念珠菌生物膜的標(biāo)記以及白念珠菌與宿主細(xì)胞相互作用的研究［1-4］。既往有研究使用CFW和熒光Con A標(biāo)記活的白念珠菌后與細(xì)胞進(jìn)行相互作用［5-6］。然而，白念珠菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)和甘露聚糖均為可識別宿主細(xì)胞的重要病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）［7-8］，其經(jīng)熒光標(biāo)記后的結(jié)構(gòu)變化是否會影響白念珠菌的生長活性和識別粘附細(xì)胞的能力？此問題既往尚無研究。因此，本研究通過使用CFW和Alexa Fluor 488-Con A（熒光染料Alexa Fluor 488和Con A結(jié)合形成熒光Con A）兩種熒光染料標(biāo)記白念珠菌，并將標(biāo)記后的白念珠菌分別與巨噬細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，探討兩種熒光染料對白念珠菌生長活性和粘附能力的影響，以明確在念珠菌和宿主細(xì)胞相互作用研究中鈣熒光白和熒光刀豆蛋白A是否適用于活念珠菌的標(biāo)記，為白念珠菌熒光染料的選擇提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究使用的菌株為白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株SC5413及19株我院保藏的白念珠菌臨床株。將白念珠菌接種于酵母提取物蛋白胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）肉湯培養(yǎng)基（BD公司，242820），放置在30℃搖床中孵育過夜。次日，使用PBS緩沖液將白念珠菌細(xì)胞清洗3遍，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求制備不同濃度的菌懸液。

1.2 細(xì)胞

巨噬細(xì)胞系RAW264.7及腸上皮細(xì)胞系caco2，均購于美國模式培養(yǎng)物保藏中心。將RAW264.7細(xì)胞接種于含10%小牛血清（Sigma，F(xiàn)2442）的DMEM培養(yǎng)基（Sigma，D6429），放置在體積分?jǐn)?shù)5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長至80%時(shí)融合時(shí)使用細(xì)胞刮輕刮下細(xì)胞后傳代。將caco2細(xì)胞接種于含200 mL/L小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長至80%融合時(shí)使用0.25%EDTA-胰酶（Gibco，25200114）消化后傳代。

1.3 CFW及Con A熒光染色

使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板將孵育過夜的白念珠菌懸液調(diào)整至（1-5）×106/mL，離心后去除上清液，剩余白念珠菌細(xì)胞。CFW染色：根據(jù)既往文獻(xiàn)［7］，取200 μL CFW（1 mg/mL，Sigma，18909）滴于含白念珠菌細(xì)胞的EP管內(nèi)，置于室溫下避光孵育1 min，然后使用PBS緩沖液清洗3遍備用。Con A染色：根據(jù)既往文獻(xiàn)［6］，將Alexa Fluor 488-Con A（Invitrogen，C11252）使用PBS稀釋至200 μg/mL，取1 mL加入含有白念珠菌細(xì)胞的EP管中，于37℃避光孵育30 min。使用PBS緩沖液清洗3遍備用。

1.4 白念珠菌生長活性檢測

使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板將孵育過夜的白念珠菌菌懸液調(diào)整至（1～5）×106/mL，然后將菌懸液平均分為3組，分別為CFW組、Con A組和未染色的對照組。按照步驟1.3使用CFW對CFW組的菌懸液，使用Alexa Fluor 488-Con A對Con A組的菌懸液進(jìn)行染色。然后將每組菌懸液稀釋1 000倍至（1～5）×103/mL，每組混勻后分別取50 μL菌懸液涂于YPD平板上，置于30℃溫箱中孵育。24 h后計(jì)數(shù)每組YPD平板上的菌落數(shù)，將染色組的菌落數(shù)與對照組相比較。

1.5 粘附能力檢測

1.5.1 巨噬細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn) 將RAW264.7細(xì)胞調(diào)整至2×105/mL，接種于24孔板，每孔接種1 mL，設(shè)置CFW組、Con A組和對照組，置于含有體積分?jǐn)?shù)5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中孵育。按照步驟1.3制備3個(gè)組的菌懸液，并使用DMEM重懸菌懸液至1×106/mL。8 h后24孔板中的巨噬細(xì)胞已完全貼壁，吸去培養(yǎng)基后使用PBS將細(xì)胞清洗3遍，每組中的每孔加入相應(yīng)的1 mL菌懸液，然后將24孔板置于含有體積分?jǐn)?shù)5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。然后吸去培養(yǎng)基，使用PBS清洗細(xì)胞以去除未粘附的白念珠菌細(xì)胞。向CFW組、Con A組的樣本中加入40 g/L多聚甲醛固定10 min，然后使用PBS清洗3遍備用。將對照組樣本固定清洗后再加入體積分?jǐn)?shù)0.1%Triton X-100滲透10 min，然后使用PBS清洗3遍，加入CFW染色1 min后，再次使用PBS清洗3遍備用。

1.5.2 腸上皮細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn) 將caco2細(xì)胞調(diào)整至5×104/mL，接種于24孔板，每孔接種1 mL，設(shè)置CFW組、Con A組和對照組，置于含有體積分?jǐn)?shù)5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中孵育5 d，每隔2 d換液1次。按照步驟1.3制備3個(gè)組的菌懸液，并使用DMEM重懸菌懸液至1×106/mL。吸去24孔板中的培養(yǎng)基后使用PBS將細(xì)胞清洗3遍，每組每孔加入相應(yīng)的1 mL菌懸液，然后將24孔板置于含有5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。然后吸去培養(yǎng)基，使用PBS將細(xì)胞清洗3遍以去除未粘附的白念珠菌細(xì)胞。向CFW組、Con A組的樣本中加入40 g/L多聚甲醛固定10 min，然后使用PBS清洗3遍備用。將對照組樣本固定清洗后再加入體積分?jǐn)?shù)0.1%Triton X-100滲透10 min，然后使用PBS清洗3遍，加入CFW染色1 min后，再次使用PBS清洗3遍備用。

1.5.3 熒光顯微鏡檢測 將24孔板置于倒置熒光顯微鏡（日本Olympus IX 71）物鏡下拍照。每孔樣本拍攝10個(gè)400倍高倍視野，同時(shí)拍攝白光照片和熒光照片。拍攝熒光照片時(shí)，CFW組和對照組均使用紫外線照射，Con A組使用藍(lán)光照射。取10個(gè)高倍視野內(nèi)白念珠菌細(xì)胞的平均數(shù)為粘附的白念珠菌數(shù)目，將染色組的粘附數(shù)目和對照組相比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，且3組數(shù)據(jù)具有方差齊性時(shí)，3組之間的數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)，檢驗(yàn)均為雙尾，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)非正態(tài)分布或方差不齊時(shí)，采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)分析。有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，使用Nemenyi法兩兩比較，檢驗(yàn)均為雙尾，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白念珠菌生長活性

白念珠菌接種于YPD平板后，染色組和對照組均可長出菌落（圖1A-C），菌落長出時(shí)間約為8 h，3組之間的菌落長出時(shí)間無明顯差異。CFW組的菌落數(shù)目（94.75±19.33）和對照組的（96.80±20.63）相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.942；圖1D）；Con A組的菌落數(shù)目（93.85±19.26）和對照組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.885，圖1D）；CFW組和Con A組的菌落數(shù)目亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.989；圖1D）。

2.2 粘附巨噬細(xì)胞能力

白念珠菌與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)30 min后，在對照組，鏡下可見大量白念珠菌粘附在巨噬細(xì)胞表面，部分被巨噬細(xì)胞吞噬，部分白念珠菌長出菌絲，巨噬細(xì)胞呈梭形（圖2A-F），單個(gè)視野內(nèi)巨噬細(xì)胞個(gè)數(shù)較染色組減少。共培養(yǎng)后染色組內(nèi)的巨噬細(xì)胞呈圓形并聚集成團(tuán)狀，CFW組白念珠菌未見菌絲長出，Con A組的白念珠菌可見菌絲長出。CFW組的粘附數(shù)目45（32～48）和對照組129（134～154）的相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000；圖2G）；Con A組的粘附數(shù)目61（60～70）和對照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000；圖2G）；CFW組和Con A組的粘附數(shù)目亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000；圖2G）。

2.3 粘附腸上皮細(xì)胞能力

白念珠菌與腸上皮細(xì)胞共培養(yǎng)30 min后，在對照組，鏡下可見大量白念珠菌粘附在腸上皮細(xì)胞表面，部分被腸上皮細(xì)胞內(nèi)吞。部分白念珠菌長出菌絲，腸上皮細(xì)胞連接松散，單個(gè)視野內(nèi)腸上皮細(xì)胞的數(shù)量較染色組減少。共培養(yǎng)后染色組內(nèi)的腸上皮細(xì)胞連接緊密，CFW組白念珠菌未見菌絲長出，Con A組的白念珠菌可見菌絲長出（圖3A-F）。CFW組的粘附數(shù)目21（23～37）和對照組60（59～75）的相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000，圖3G）；Con A組的粘附數(shù)目43（40～46）和對照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000，圖3G）；CFW組和Con A組的粘附數(shù)目相比亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000，圖3G）。

圖1 白念珠菌的菌落形成單位Fig.1 Colony forming units of candida albicans

圖2 念珠菌與巨噬細(xì)胞的粘附Fig.2 Adhesion of candida albicans to macrophages

圖3 念珠菌與腸上皮細(xì)胞的粘附Fig.3 Adhesion of candida albicans to enterocytes

3 討論

在人類機(jī)體的正常生理環(huán)境下，白念珠菌作為一種內(nèi)源性真菌主要存在于口腔、消化道和陰道等腔道表面；當(dāng)機(jī)體免疫功能低下時(shí)，白念珠菌通過粘附腔道的上皮細(xì)胞侵入體內(nèi)，并和體內(nèi)免疫細(xì)胞相互作用，因此本研究選用腸上皮細(xì)胞系和巨噬細(xì)胞系觀察白念珠菌的粘附能力。在本研究中，因CFW僅識別纖維素和幾丁質(zhì)，而巨噬細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞不含纖維素和幾丁質(zhì)，所以使用CFW對固定滲透后的對照組樣本染色。CFW僅使白念珠菌著色，在熒光顯微鏡下可以計(jì)數(shù)粘附的念珠菌數(shù)目。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CFW染色后的白念珠菌和細(xì)胞共培養(yǎng)半小時(shí)后未長出菌絲，而對照組白念珠菌則長出菌絲，說明CFW與白念珠菌結(jié)合后影響了白念珠菌的正常出芽。既往研究［9］證明CFW與白念珠菌結(jié)合后，通過抑制幾丁質(zhì)晶格的形成改變了幾丁質(zhì)在細(xì)胞壁的分布和結(jié)構(gòu)，而白念珠菌孢子出芽形成菌絲的過程受幾丁質(zhì)合成酶和幾丁質(zhì)酶合成降解幾丁質(zhì)調(diào)控，CFW結(jié)合導(dǎo)致的幾丁質(zhì)分布和結(jié)構(gòu)改變可能打破了幾丁質(zhì)合成和降解的平衡，從而影響了白念珠菌的出芽進(jìn)程。

既往研究已經(jīng)證實(shí)白念珠菌的幾丁質(zhì)是一種PAMP，識別巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體9（Tolllike receptor 9，TLR9）和甘露聚糖受體，釋放IL-10抑制炎癥［10］，還可阻斷dectin-1介導(dǎo)的免疫識別，抑制細(xì)胞因子的釋放［7］。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)CFW染色后的白念珠菌對巨噬細(xì)胞的粘附能力降低，且共培養(yǎng)半小時(shí)后未誘發(fā)巨噬細(xì)胞分化，我們推測CFW結(jié)合幾丁質(zhì)后改變了幾丁質(zhì)的抗原性，進(jìn)而導(dǎo)致白念珠菌粘附巨噬細(xì)胞的能力下降。

本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)熒光Con A染色后的白念珠菌粘附巨噬細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞的能力均下降。甘露聚糖是白念珠菌細(xì)胞壁上的重要抗原［11］，白念珠菌甘露聚糖可以識別巨噬細(xì)胞表面的甘露聚糖受體和TLR4受體啟動免疫反應(yīng)［12］，甘露聚糖結(jié)合凝集素通過識別TLR2和TLR4啟動巨噬細(xì)胞的細(xì)胞免疫［13］，甘露聚糖識別dectin-2誘導(dǎo)TH17細(xì)胞分化［14-15］；甘露聚糖在體外介導(dǎo)白念珠菌粘附在腸上皮細(xì)胞上［16］，因此，推測經(jīng)熒光ConA染色后的白念珠菌粘附細(xì)胞的能力減少可能與Con A與甘露聚糖結(jié)合后導(dǎo)致其抗原性發(fā)生變化有關(guān)。表明CFW和熒光Con A標(biāo)記白念珠菌后不影響其生長活性，可顯著降低其粘附巨噬細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞的能力，鈣熒光白染色影響白念珠菌的出芽過程。因此，在研究白念珠菌和宿主細(xì)胞相互作用時(shí)，CFW和熒光Con A不適用于標(biāo)記活的白念珠菌。

（致謝：衷心感謝喬治城大學(xué)李冬梅教授在實(shí)驗(yàn)中給予的指導(dǎo)）