通過抑制ATM上調(diào)Bim促進小腦顆粒神經(jīng)元凋亡

劉鍶鍶，曾淑蓮，吳力強，黃紫燕，郅 程，王業(yè)忠，袁忠民

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科//神經(jīng)外科疾病研究中心，廣東 廣州 510260）

凋亡是程序性死亡的主要重要形式，其與細胞增殖共同維持機體正常生長發(fā)育和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［1］。神經(jīng)退行性疾病是由神經(jīng)元及其髓鞘喪失而出現(xiàn)功能障礙的一類神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括阿爾茲海默癥、帕金森病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥等［2］。這些疾病的共同的病理改變是大量細胞凋亡引起腦內(nèi)神經(jīng)元減少［3］。細胞凋亡涉及一系列基因的調(diào)控及蛋白的合成，并受促凋亡基因的活化調(diào)節(jié)。DNA損傷、線粒體膜流動性降低等均可啟動線粒體依賴的凋亡通路，導(dǎo)致相關(guān)蛋白的釋放。BH3-only家族蛋白Bim上調(diào)是神經(jīng)元發(fā)生凋亡的關(guān)鍵事件，其表達上調(diào)可以促使神經(jīng)元發(fā)生線粒體依賴的凋亡［4-5］。共濟失調(diào)毛細血管擴張突變（ataxia telangiectasia mutated，ATM）蛋白是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶［6］，在DNA損傷修復(fù)中扮演著重要的角色。目前研究發(fā)現(xiàn)，DNA損傷后通過活化ATM-p38MAPKMK2通路，激活下游底物p53，從轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)基因表達，導(dǎo)致細胞凋亡［7］，表明ATM在細胞凋亡的調(diào)控中的重要作用，但在神經(jīng)元凋亡過程中ATM的作用尚不明確。我們想要探索ATM調(diào)控神經(jīng)元凋亡中的機制，并發(fā)現(xiàn)其與下游的凋亡蛋白Bim之間的調(diào)控關(guān)系，從而證實ATM對神經(jīng)元的存活具有重要意義。希望通過本研究為確立以ATM和Bim為靶治療DNA損傷引起的神經(jīng)元凋亡及相關(guān)神經(jīng)病變提供理論支持和實驗依據(jù)。本研究以SD乳鼠小腦顆粒神經(jīng)元作為研究對象建立體外神經(jīng)元存活和凋亡模型，探討ATM在小腦顆粒神經(jīng)元凋亡過程中的作用與機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

出生7～8 d SD乳鼠，性別不限，購于中山大學(xué)實驗動物中心。Basal Medium Eagle（BME）和Fetal bovine serum購于美國Gibco公司。鈣磷轉(zhuǎn)染試劑盒購于美國Promega公司。細胞實驗所用24孔板和6孔板購自美國Corning公司。ECL發(fā)光試劑和Hoechst 33258熒光染料購于美國Sigma公司。KU-55933購于Selleck公司。Anti-ATM、Anti-p-ATM、Anti-Bim、Anti-Caspase 3、Anti-GAPDH購自美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)元的原代培養(yǎng) 小腦顆粒神經(jīng)元來自7～8 d SD乳鼠（15～19 g）。從健康的乳鼠腦組織中分離出小腦組織，機械破碎后用胰酶以及DNA酶處理得到單細胞懸液，以1.5×106cells/mL的密度接種于細胞板中，置于37℃、體積分數(shù)為5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含10%FBS的BME，以及 25 mmol/L KCl［8］。接種后 24 h 添加阿糖胞苷（10 μmol/L）限制膠質(zhì)細胞的生長。細胞在體外培養(yǎng)7 d后，用含鉀離子濃度為25 mmol/L或5 mmol/L的無血清培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，實驗組用 KU-55933（10 μmol/L）處理細胞，不添加抑制劑的細胞組加入DMSO作為對照。

1.2.2 免疫印跡法 直接加入含DTT的上樣緩沖液收集細胞，超聲，變性、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，分別加入一抗（1∶1 000）：p-ATM、ATM、Bim、Caspase 3、GAPDH、β-tubulin，4℃搖晃過夜，第2天用TBST洗膜10 min×3次，再分別加入對應(yīng)種屬的二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次后行ECL發(fā)光，應(yīng)用膠片曝光。

1.2.3 凋亡測定 處理小腦顆粒神經(jīng)元后，加入Hoechst 33258（1∶200）染料，置于37 ℃培養(yǎng)箱染色1 h后，于熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。通過相對于同一視野中核固縮的細胞數(shù)與同一視野中細胞總數(shù)的比值來表示神經(jīng)元凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料采用均數(shù)±標準差（）或四分位數(shù)P50（P25，P75）表示。首先對樣本進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，對符合正態(tài)分布并且方差齊性的數(shù)據(jù)，兩樣本均數(shù)的比較采用兩獨立樣本t檢驗；3組及以上樣本的均數(shù)比較采用單因素方差分析，隨后的組間比較采用LSD法；否則3組及以上樣本的均數(shù)比較采用H檢驗；P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在體外神經(jīng)元凋亡（5K）條件下，ATM及其磷酸化水平降低

為了研究ATM在小腦顆粒神經(jīng)元凋亡中的作用，我們首先利用25和5 mmol/L KCl在體外建立神經(jīng)元存活（25 K組）和凋亡（5 K組）模型。Caspase 3是凋亡特異性標志物，其活化型（Cleaved-caspase 3）的表達水平可以反映細胞凋亡情況，而Bim上調(diào)是誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)生線粒體依賴凋亡及Caspase 3激活的關(guān)鍵事件。Western Blot實驗結(jié)果顯示，與25 K組比較，5 K組Cleavedcaspase 3表達水平升高（P＜0.05），同時Bim表達也增加（P＜0.05，圖1），說明成功建立體外神經(jīng)元凋亡模型。此外與25 K組比較，5 K組的p-ATM和ATM的表達水平下降（P＜0.05；圖1）。

圖1 5 K條件下小腦顆粒神經(jīng)元ATM及其磷酸化水平降低Fig.1 5K caused a significant reduction in ATM and p-ATM in CGN

2.2 在25 K條件下，抑制ATM導(dǎo)致Bim表達水平增加，Caspase 3激活

在25 K條件下，我們利用KU-55933抑制ATM活性，與25 K組比較，ATM抑制組中p-ATM、ATM的表達均降低（P＜0.05；圖2B），說明KU-55933使p-ATM和ATM的表達水平下降。同時Bim、Cleaved-caspase 3的表達水平均升高（P＜0.05；圖2C），提示抑制ATM能夠使小腦顆粒神經(jīng)元發(fā)生線粒體依賴的凋亡。

2.3 在25 K條件下，抑制ATM增加神經(jīng)元核固縮率

隨后在25 K條件下，我們利用KU-55933抑制ATM后進行Hoechst染核，觀察小腦顆粒神經(jīng)元的核固縮情況。與25 K組比較，5 K組和ATM抑制組的凋亡率均增加（P＜0.05；圖3）。

2.4 抑制Bim將降低ATM抑制劑引起的神經(jīng)元凋亡率

為進一步探討抑制ATM是否導(dǎo)致Bim依賴的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡，在抑制ATM條件下，分別用光輝霉素A（Mithramycin A，MMA）和色霉素A3（Chromomycin A3，CMA3）處理細胞，檢測其對Bim和Caspase 3表達的影響［9］。在ATM抑制組中，與對照相比Bim的表達增加（P＜0.05；圖4A、B）且Cleaved-caspase 3表達增加（P＜0.05）。而MMA和CMA3能顯著抑制KU-55933誘導(dǎo)的Bim表達和Cleaved-caspase 3活性（P ＜0.05；圖4B、C）。

接下來，我們同時抑制Bim和ATM后進行Hoechst染核色，觀察小腦顆粒神經(jīng)元的核固縮情況。與ATM抑制組比較，MMA組、CMA3組中小腦顆粒神經(jīng)元核固縮率降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05；圖4D、E）。

3 討論

凋亡是許多生理和病理過程中細胞發(fā)生程序性死亡的主要形式，一直以來都是科學(xué)研究熱點。而神經(jīng)元的凋亡被認為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的正常特征，并在神經(jīng)退行性疾病和衰老中有重要的作用。例如在神經(jīng)退行性疾病中，阿爾茨海默病的特征性病理變化之一是腦內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，而帕金森病的主要病理特征是多巴胺能神經(jīng)元的減少［10］。在腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡受到一系列基因的調(diào)控以及蛋白表達的影響，包括促凋亡基因的活化調(diào)節(jié)。其中，經(jīng)典的線粒體依賴的凋亡通路是，當細胞受到各種因素刺激后，細胞色素C從線粒體中釋放，與凋亡活化因子-1（Apaf-1）、pro-Caspase 9形成凋亡體，激活Caspase 9，繼而激活下游Caspase 3，引起細胞凋亡［11］。有許多因素可能引發(fā)神經(jīng)細胞凋亡，低鉀（low potassium，也有文獻稱撤鉀，potassium deprivation，本文稱5 K）是其中一種。在CGN的培養(yǎng)中，可以通過去極化細胞外鉀離子（25 mmol/L KCl，25 K）的濃度來維持CGN存活，當鉀離子濃度降低至5 mmol/L KCl（撤鉀）時會引發(fā)典型的細胞凋亡［12］，該模型被廣泛用于研究神經(jīng)元凋亡的機制［9］。我們在5 K條件下檢測到Caspase 3的激活，成功建立體外神經(jīng)元凋亡模型。在此模型上，我們發(fā)現(xiàn)在5 K的條件下ATM的表達水平降低。ATM是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，在協(xié)調(diào)DNA損傷反應(yīng)中起重要作用，包括細胞周期檢查點控制，DNA修復(fù)和細胞凋亡［13］。當細胞發(fā)生DNA損傷時，胞內(nèi)識別DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks，DSB），ATM蛋白無活性的二聚體分子內(nèi)發(fā)生自身磷酸化，解離成有活性的ATM蛋白單體，進而誘發(fā)下游相應(yīng)底物發(fā)生一系列的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，最終引起細胞周期阻滯、DNA修復(fù)或細胞凋亡［14］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)元中抑制ATM后能上調(diào)Bim的表達，激活了Caspase 3，導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡，提示ATM在調(diào)控細胞凋亡發(fā)揮重要的作用。

圖2 25 K條件下抑制ATM增加Bim和Caspase 3的表達Fig.2 Inhibition of ATM induced Bim expression and Caspase 3 activationat 25 K

圖3 抑制ATM增加小腦顆粒神經(jīng)元核固縮率Fig.3 ATM inhibition increased the nuclear pyknosis rate of cerebellar granule neurons

Bim是Bcl-2家族成員之一，屬于促凋亡的BH3亞家族。它只含有一個BH3同源結(jié)構(gòu)域，表達上調(diào)可以促進線粒體依賴的細胞凋亡［4-5］。研究報道，BH3-only家族蛋白Bim上調(diào)是神經(jīng)元發(fā)生凋亡的關(guān)鍵事件［4］。而Bim的表達上調(diào)是由上游活性分子進行調(diào)控的，研究發(fā)現(xiàn)抑制CaMK II能上調(diào)Bim的表達進而引起神經(jīng)元凋亡［15］。同時有研究報道［9］，GCN5的表達下調(diào)也能夠誘導(dǎo)Bim依賴的神經(jīng)元凋亡。而本研究發(fā)現(xiàn)，抑制ATM后Bim的表達水平升高，進而激活Caspase 3，引起神經(jīng)元凋亡，說明ATM通過調(diào)控Bim的表達從而發(fā)揮調(diào)控細胞凋亡的作用。Wu等［9］報道Egr-1通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控Bim的表達從而調(diào)節(jié)細胞凋亡。我們同時抑制Egr-1的轉(zhuǎn)錄活性和ATM后發(fā)現(xiàn)，Bim的表達水平顯著減少，神經(jīng)元的凋亡率也隨之降低，說明抑制ATM可能通過上調(diào)Egr-1的轉(zhuǎn)錄活性從而上調(diào)Bim的表達，導(dǎo)致小腦顆粒神經(jīng)元凋亡。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)在小腦顆粒神經(jīng)元中，ATM活性通過抑制Bim表達促進細胞存活，而ATM表達減少會使促凋亡蛋白Bim的表達增加，激活Caspase 3，進而導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)生凋亡。據(jù)我們所知，這是ATM調(diào)控神經(jīng)元存活和凋亡的新機制。本研究為確立以ATM和Bim為靶治療DNA損傷引起的神經(jīng)元凋亡及相關(guān)神經(jīng)病變提供理論支持和實驗依據(jù)。ATM調(diào)控Bim的機制仍需進一步研究。

圖4 抑制Bim降低ATM抑制劑引起的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡Fig.4 Inhibition of Bim by Mithramycin A or Chromomycin A3 decreased the apoptotic rate of cerebellar granule neurons induced by ATM inhibitor