血漿外泌體源性miR-1224-5p在重癥肌無力患者中的表達及診斷價值

徐宏炎 李夢夏 梁大業(yè) 葛雪晴 包卓華 韋敏光 劉競麗 李勁頻

重癥肌無力(myasthenia gravis,MG)是一種自身抗體介導、T細胞依賴,累及神經-肌肉接頭的自身免疫性疾病[1]。各年齡段均可發(fā)病,可反復發(fā)作,波動進展甚至出現肌無力危象而危及生命,早期診斷有利于疾病的控制。尋找眼肌型與全身型的分型標志物有助于進一步研究兩者間不同的發(fā)病機制。目前MG的診斷依賴于典型臨床表現、新斯的明試驗陽性、重復電刺激低頻遞減等,與MG相關的生物標志物如血清乙酰膽堿受體抗體(ACh R-Ab)、抗骨骼肌抗體等尚不能對進行分型診斷及預后判斷[2]。因此尋找靈敏度及特異度更高的分型診斷標志物具有重要臨床意義。

microRNA(miRNA)是一種內生的,長度約22個核苷酸的非編碼單鏈RNA,可通過靶向結合信使RNA(m RNA)在轉錄后水平調控基因的表達水平。研究表明,miRNA的表達異常與腫瘤、炎性反應及自身免疫性疾病(如MG)相關[3-5],并可作為疾病的生物標志物[6-10],但miRNA具有易降解的特點,降低了其作為生物標志物的能力。外泌體作為細胞分泌的泡狀小體,內含多種蛋白、脂質、核酸分子,能保護RNA免受核酸酶的降解,是血漿miRNA富集體;外泌體源性miRNA能反映來源細胞的功能、狀態(tài),可預測疾病的演變和治療反應,具有作為生物標志物的潛力[11-12]。本研究通過深度測序及qRT-PCR技術檢測MG患者血漿外泌體源性miRNA的表達差異,并評估其作為生物標志物的可能性。

1 對象和方法

1.1 對象納入2017年3月至2018年7月在廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經內科就診的MG患者44例,其中眼肌型18例,全身型26例。MG診斷標準:(1)表現為骨骼肌無力,伴有典型的活動后癥狀加重、休息后減輕或晨輕暮重現象,且肌疲勞試驗陽性。(2)新斯的明試驗陽性。(3)肌電圖檢查呈現低頻重復神經電刺激波幅遞減和(或)單纖維肌電圖顫抖(Jitter)增寬。(4)血清AChR-Ab升高。具備上述診斷標準中的(1),同時至少具備(2)～(4)中的一項,即診斷為MG。排除標準:排除妊娠期女性,以及合并心、肺、肝、腎功能衰竭者。另選擇同期性別、年齡相匹配的健康體檢者44名作為對照組。本研究經作者醫(yī)院倫理委員會批準通過,入組者及家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集:收集入組對象性別、年齡情況,并記錄 MG患者病程、合并其他免疫性疾病(甲狀腺功能亢進、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征)、抗ACh R-Ab、胸腺病理檢查以及治療等情況。根據美國MG協會提出的定量重癥肌無力評分(QMGS)進行病情嚴重程度評價。

1.2.2 主要試劑與設備:包括外泌體試劑盒exo RNeasy Serum/Plasma Midi Kit(德國Qiagen公司)、H7650透射電鏡(日本日立公司)、納米粒徑分析儀(ZETASIZER Nano series-Nano-ZS,英國Malvern公司)、流式細胞儀(美國BD公司)、exoRN-easy Serum/Plasma Maxi Kit試劑盒(德國 Qiagen 公司)、Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit試劑盒 (日本Ta KaRa公司)、Applied Biosystems 7500熒光定量PCR儀(美國 Applied Biosystems公司)、CD63-Antibody及CD81-Antibody(美國BD公司)、PCR引物(日本TaKaRa公司)、熒光定量PCR試劑盒(日本Ta KaRa公司)。

1.2.3 血漿采集:用含EDTA抗凝管采集全血5 m L,4℃靜置2 h,以3300g離心15 min,取上清,分裝至微型離心管并保存至-80℃冰箱備用。

1.2.4 外泌體的鑒定:取700μL血漿,按外泌體試劑盒exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit說明書提取外泌體,并進行外泌體鑒定。(1)外泌體鑒定:將外泌體懸浮于無酶水中,滴于200目銅網,靜置1 min,干燥后用1%(質量濃度)磷鎢酸染色20 s,樣本干燥后在透射電鏡下觀察外泌體形態(tài)。(2)粒徑檢測:使用納米粒徑分析儀對樣本粒徑進行檢測(由廣州銳博公司檢測)。(3)表面標志物檢測:采用流式細胞儀對樣本表面特異性標志蛋白CD63和CD81進行檢測(由廣州銳博公司檢測)。

1.2.5 提取外泌體小RNA進行深度測序:隨機選擇眼肌型、全身型MG患者各4例以及對照組2名血漿樣本送銳博生物有限公司(中國,廣州)進行檢測。取長度為18～30核苷酸的小RNA構建文庫,基于Illumina HiSeq 2500平臺對上述文庫進行深度測序,采用Edge R軟件分析比較兩組間的miRNA表達差異。

1.2.6 提取RNA進行實時熒光定量PCR:采用exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit試劑盒提取MG患者及正常對照者血漿外泌體源性RNA,使用Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit試劑盒逆轉錄合成cDNA。使用熒光定量PCR試劑盒及Applied Biosystems 7500熒光定量PCR儀,使用U6作為內參進行PCR檢測。使用ABI 7500 Software V2.3計算其CT值,通過2-ΔΔCt公式計算MG患者與正常組miRNA相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理使用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析,對數據進行正態(tài)性和方差齊性檢驗,符合正態(tài)分布的計量資料用均數±標準差表示,兩均數間比較采用t檢驗,多組均數間比較采用方差分析;非正態(tài)分布的計量資料采用中位數和四分位數間距表述,兩組間比較采用Mann-Whitney檢驗,多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗,兩兩比較采用Nemenyi法檢驗;計數資料采用χ2檢驗,當n＜40或T＜1時采用四表格確切概率法;MG患者外泌體源性miRNA表達與MG病情嚴重程度的相關性采用Spearman相關分析;繪制ROC曲線評估m(xù)iRNA對MG的診斷價值。以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組臨床資料比較44例MG患者中6例患者合并其他免疫性疾病,各組間性別、年齡、AChRAb、胸腺瘤、合并疾病、藥物治療及病程比較均無統(tǒng)計學差異(均P＞0.05)。具體結果見表1。

2.2 外泌體鑒定透射電鏡下觀察外泌體直徑約為100 nm(圖1),粒徑檢測顯示其平均粒徑41.8 nm,其中20～200 nm者占81.6%,粒徑分布系數為0.475。流式細胞儀檢測結果顯示CD63陽性率85.7%,CD81陽性率60.0%(圖2)。上述結果表明所提取外泌體符合正常特征。

圖1 電鏡下觀察外泌體形態(tài)特征(箭頭所示)

2.3 血漿外泌體源性miRNA相對表達量深度測序結果示,與對照組比較,MG患者血漿中存在68個miRNA異常表達(以差異倍數＞1.5,P＜0.05為界限),其中43個miRNA下調,25個miRNA上調(表2)。qRT-PCR檢測結果顯示,眼肌型 MG、全身型 MG、對照組血漿外泌體源性miR-1224-5p表達水平中位數(四分位數間距)分別為6.41(3.61)、14.18(13.49)、2.74(2.91),各組間其相對表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義(H=46.325,P=0.000),兩兩比較顯示,眼肌型組其水平較對照組升高(Z=-21.578,P=0.008),全身型組較眼肌型組升高(Z=-21.098,P=0.021)。結果見圖3。

表1 各組臨床資料比較

圖2 流式細胞儀檢測外泌體表面特異性標志CD63和CD81表達水平

表2 血漿外泌體源性miRNA深度測序結果

2.4 外泌體源性miRNA表達與MG病情嚴重程度相關性MG患者血漿外泌體源性miR-1224-5p相對表達量與QMGS呈正相關(r=0.428,P=0.004)。結果見圖4。

圖3 各組血漿外泌體miR-1224-5p相對表達水平比較

圖4 MG患者血漿外泌體miR-1224-5p相對表達量與病情嚴重程度相關分析

2.5 血漿外泌體源性miRNA相對表達量與AChR-Ab的關系共33例MG患者檢測血漿ACh R-Ab,其中ACh R-Ab陽性22例,陰性11例(表1)。AChR-Ab陽性組和陰性組miR-1224-5p相對表達水平中位數(四分位數間距)分別為33.18(28.11)、44.83(39.67),兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(Z=-0.191,P=0.849)。

2.6 血漿外泌體源性miR-1224-5p在MG中的診斷價值ROC曲線分析結果顯示,與健康對照組相比,眼肌型和全身型MG組其ROC曲線下面積分別為0.793(P＜0.01)、0.932(P＜0.01);與眼肌型MG相比,全身型MG組其ROC曲線下面積為0.806(P=0.001)(圖5)。

3 討論

MG按病變累及部位可分為眼肌型與全身型,兩者在發(fā)病機制、流行病學、治療策略及預后方面均存在差異[13-14]。眼肌型多為晚發(fā)型,男性多見,胸腺多正?；蛭s,部分患者病情加重可進展為全身型;全身型多為早發(fā)型,女性多見,常有胸腺增生或合并胸腺瘤[15]。尋找與MG相關,尤其是能對分型進行診斷的生物標志物有利于探討MG發(fā)病機制,有利于MG的診斷、確定藥物靶向以及精準治療。ACh R-Ab是研究較為深入的MG致病性抗體,眼肌型MG患者其陽性率約50%,全身型約80%[16],但其并非MG的特異性抗體,在急性脊髓炎、視神經脊髓炎[17]、Lambert-Eaton綜合征[18]、肌萎縮側索硬化[19]等其他免疫性疾病及健康人群中亦可發(fā)現ACh R-Ab[20]。越來越多研究結果顯示,除AChR-Ab外,諸如連接素抗體(anti-Titin antibody,Titin-Ab)、Ryanodine受體抗體(Ryanodine receptor antibody,Ry R-Ab)、肌肉特異性酪氨酸激酶抗體(muscle specific tyrosine kinase antibody,MuSK-Ab)、低密度脂蛋白受體相關蛋白4抗體(LPP4-Ab)等相關抗體均可能與MG發(fā)病相關。如有研究發(fā)現Titin-Ab及Ry R-Ab與MG病情嚴重程度相關[21-22],但與治療反應及MG分型關系的報道較少;MuSK-Ab、LRP4-Ab在 MG患者中陽性率較低,分別為4.2%和1%～5%[23],且其特異性不高,尚可見于其他免疫性疾病[24]。因此,目前尚缺乏用于MG診斷的可靠生物標志物。高通量測序技術及針對外泌體小RNA功能研究的發(fā)展為尋找新型生物標志物提供了前提條件。

圖5 血漿外泌體源性miR-1224-5p診斷MG的ROC曲線分析結果

本研究通過對MG患者血漿外泌體源性RNA深度測序發(fā)現,與健康人相比,miR-1224-5p在MG患者中表達明顯上調,通過靶基因預測網站miR3.0(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)和生物通路數據網站KEGG(https://www.kegg.jp/kegg/)分析發(fā)現,其靶基因富集于多個與免疫反應及腫瘤發(fā)生發(fā)展相關的通路[25-26],如hsa04660_T_cell_receptor_signaling_pathway,hsa04068_Fox O_signaling_pathway,hsa04010_MAPK_signaling_pathway[27]。有研究表明其在結腸癌、肺癌中異常表達,且與臨床治療和預后相關[28-30],有研究還發(fā)現了其靶基因包含MG相關的風險基因[27],提示其與腫瘤及免疫性疾病相關。本研究進一步行qRT-PCR檢測發(fā)現,miR-1224-5p在眼肌型及全身型MG患者中的表達均較正常對照組升高,且全身型患者其表達較眼肌型高,相關性分析顯示其表達與MG病情嚴重程度呈正相關,提示其表達水平與MG的發(fā)生可能存在一定相關性。MG的臨床特征與胸腺病理及AChR-Ab密切相關[13,16]。本研究并未發(fā)現胸腺增生組和胸腺瘤組、ACh R-Ab陽性組和陰性組之間血漿外泌體源性miR-1224-5p表達存在統(tǒng)計學差異,提示miR-1224-5p的表達與胸腺病理分類及AChR-Ab可能無明顯相關性。ROC曲線分析顯示,與健康對照組比較,血漿外泌體源性miR-1224-5p診斷眼肌型和全身型MG患者的ROC曲線下面積分別為0.793和0.932;與眼肌型比較,其在診斷全身型MG組的ROC曲線下面積為0.806,提示血漿外泌體源性miR-1224-5p可能成為MG診斷及分型的生物標志物。

綜上所述,本文研究結果顯示血漿外泌體源性miR-1224-5p有可能成為MG分型診斷的生物標志物。但本研究存在如下不足:首先納入樣本量較小,尚缺乏代表性;其次,僅在qRT-PCR水平檢測血漿外泌體源性miR-1224-5p的表達,有必要結合其靶基因表達水平進行功能研究;第三,目前僅檢測miRNA-1224-5p在MG與健康人之間的表達差異,為驗證其特異性,需要進一步收集其他神經系統(tǒng)免疫性疾病作為對照組進行研究。因此,有關血漿外泌體源性miR-1224-5p在MG致病機制、診斷分型中的確切作用尚需進一步研究。