單程直驅(qū)超高壓納升泵的研制與評(píng)價(jià)

楊三東,董智勇,韓 雪,馬 周,唐 濤,王風(fēng)云,李 彤*

(1. 南京理工大學(xué)工業(yè)化學(xué)研究所, 江蘇 南京 210094; 2. 大連依利特分析儀器有限公司,遼寧 大連 116023; 3. 大連市色譜工程技術(shù)研究中心, 遼寧 大連 116023)

高效液相色譜儀(HPLC)是分析化學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的分析儀器之一。隨著生命科學(xué)的發(fā)展,在蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域,HPLC被越來(lái)越多地應(yīng)用于生物組織的分析研究[1-3]。納升液相色譜系統(tǒng)是分析生物樣品的常用工具,通過(guò)使用更細(xì)內(nèi)徑的色譜柱和流體管路,可以有效降低系統(tǒng)中樣品的擴(kuò)散,提高分析的質(zhì)量靈敏度,且能夠直接與質(zhì)譜儀聯(lián)用[4-6]。

納升液相色譜系統(tǒng)的使用流速通常在每分鐘幾百納升,如此低的流速難以通過(guò)常規(guī)輸液泵直接實(shí)現(xiàn)[7]。利用三通將常規(guī)輸液泵輸出的流速進(jìn)行分流是實(shí)現(xiàn)納升流速最常用的方法,分流比由兩條支路的阻力比決定,且與阻力比呈倒數(shù)[8]。盡管能夠通過(guò)較大的分流比實(shí)現(xiàn)較低流速的輸出,但由于系統(tǒng)阻力會(huì)隨著流動(dòng)相組成、色譜柱性質(zhì)、溫度等發(fā)生變化,使分流流速不穩(wěn)定,并且對(duì)于梯度洗脫模式來(lái)說(shuō),阻力小的一端排出的大量流動(dòng)相難以回收再利用,造成流動(dòng)相的浪費(fèi)[9]。因此,研制無(wú)分流輸液的納升梯度泵對(duì)系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用具有重要意義。

商品化納升梯度輸液泵主要有兩種結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)[10,11],一種是泵腔串聯(lián)的連續(xù)輸液泵結(jié)構(gòu),另一種是利用多個(gè)切換閥控制流動(dòng)相流動(dòng)路徑的注射泵結(jié)構(gòu),二者都利用高精度電機(jī)和流速反饋控制保證輸液精度。但前者的結(jié)構(gòu)中有多個(gè)單向閥結(jié)構(gòu),穩(wěn)定性較差,后者的結(jié)構(gòu)中有多個(gè)切換閥機(jī)構(gòu),成本較高且控制流程復(fù)雜?；谄渌锢硇再|(zhì)驅(qū)動(dòng)液體的輸液泵也可實(shí)現(xiàn)納升流速的輸送。Zhou等[12]利用載流的電滲現(xiàn)象驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相,研制了一種雙元電滲梯度泵,最大輸出流速為490 nL/min,最大輸出壓力可達(dá)40 MPa。朱玉川等[13]利用稀土超磁致伸縮材料在磁場(chǎng)中可發(fā)生形變的現(xiàn)象發(fā)明了一種超磁致伸縮液壓泵,其優(yōu)點(diǎn)在于輸出流速低,機(jī)械結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,但目前尚無(wú)實(shí)際應(yīng)用的報(bào)道?；谝后w受熱膨脹驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相流動(dòng)的原理,Tao等[14]構(gòu)建了一種能夠?qū)崿F(xiàn)梯度洗脫的熱膨脹泵,在500 nL/min流速條件下,流速重復(fù)性的RSD為4%,色譜保留時(shí)間重復(fù)性的RSD為2%,將膨脹介質(zhì)水的溫度從25 ℃提高至95 ℃時(shí),輸液壓力可達(dá)100 MPa。本課題組[15]基于物質(zhì)發(fā)生固液相變時(shí)體積改變的現(xiàn)象發(fā)明了一種相變輸液泵,其輸液流速低至100 nL/min,最大耐壓可達(dá)80 MPa。上述幾種輸液泵雖然能夠以納升級(jí)流速輸送流動(dòng)相,但系統(tǒng)的穩(wěn)定性,控制的復(fù)雜程度均制約其進(jìn)一步的應(yīng)用。

本文利用高精度直驅(qū)電機(jī)和一個(gè)高壓兩位十通切換閥構(gòu)建了一種單程直驅(qū)超高壓納升泵,簡(jiǎn)稱(chēng)納升泵,對(duì)其輸液性能進(jìn)行了評(píng)價(jià),并構(gòu)建了一套能夠用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的納升液相色譜系統(tǒng)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

納升泵(自構(gòu)建), P230Ⅱ高壓恒流泵(大連依利特分析儀器有限公司),兩位六通閥C72X-6696EH(配5 μL定量環(huán))、兩位十通閥C82X-6670EUD(瑞士VICI公司), nF-1500微納流量計(jì)(大連依利特分析儀器有限公司), K2501紫外檢測(cè)器(20 nL檢測(cè)池,德國(guó)Knauer公司), LTQ XL質(zhì)譜儀、Q Exactive質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)。

末端錐形的C18毛細(xì)管分離柱(150 mm×75 μm, 5 μm)、C18捕集柱(30 mm×150 μm, 5 μm)(中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所1810組提供)。甲酸、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、胰蛋白酶(Trypsin, bovine pancreas)、牛血清白蛋白(BSA)均為分析純,購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;丙酮、碳酸氫銨均為分析純,購(gòu)自天津科密歐公司。乙腈(色譜純)購(gòu)于德國(guó)Merck公司,蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.25 g/L的Hela細(xì)胞蛋白質(zhì)提取液由中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所1810組提供。超純水(Milli-Q,德國(guó)Millipore公司)。

1.2 樣品制備

BSA酶解液:取1 mg BSA溶于1 mL 50 mmol/L碳酸氫銨溶液中,配置成1 g/L的BSA溶液。將1 mL BSA溶液(1 g/L)置于90 ℃水浴中熱變性15 min,然后加入8 μL 1 mol/L DTT,在56 ℃水浴中反應(yīng)1 h,之后避光加入20 μL 1 mol/L IAA,避光靜置40 min,最后加入40 μL 1 g/L trypsin(酶與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1∶25),在37 ℃水浴下反應(yīng)10 h。反應(yīng)結(jié)束后,加1 μL甲酸終止酶解,即得到質(zhì)量濃度為1 g/L的BSA酶解液。

Hela細(xì)胞蛋白質(zhì)酶解液:將1 mL 0.25 g/L Hela細(xì)胞蛋白質(zhì)提取液置于90 ℃水浴中熱變性15 min,然后加入8 μL 1 mol/L DTT,在56 ℃水浴中反應(yīng)1 h,之后避光加入20 μL 1 mol/L IAA,避光靜置40 min,最后加入40 μL 1 g/L trypsin(酶與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為4∶25)在37 ℃水浴下反應(yīng)16 h。反應(yīng)結(jié)束后,加1 μL甲酸終止酶解,即得到質(zhì)量濃度為0.25 g/L的Hela細(xì)胞蛋白質(zhì)酶解液。

1.3 納升泵輸液評(píng)價(jià)

1.3.1納升流速測(cè)試

納升泵出口與nF-1500微納流量計(jì)相連,流動(dòng)相A、B均為純水,分別設(shè)定A、B泵頭的流速為50、100、150、200、300、500、700和1 000 nL/min,測(cè)試實(shí)際的輸液流速,計(jì)算實(shí)際流速與設(shè)定流速的偏差以及瞬時(shí)流速穩(wěn)定性的RSD值。

1.3.2納升泵耐壓測(cè)試

用絲堵堵住納升泵的出口,流動(dòng)相A、B均為純水,同時(shí)設(shè)置A、B泵頭的流速為5 μL/min進(jìn)行升壓,監(jiān)控并記錄兩泵頭平均壓力隨時(shí)間的變化情況。

1.3.3納升泵梯度測(cè)試

納升泵出口直接與K2501紫外檢測(cè)器的檢測(cè)池相連,流動(dòng)相A為純水,流動(dòng)相B為0.6%(體積分?jǐn)?shù),下同)丙酮水溶液。線(xiàn)性梯度測(cè)試條件:0～2 min, 100%A; 2～32 min, 100%A～100%B; 32～50 min, 100%A。臺(tái)階梯度測(cè)試條件:0～5 min, 5%B; 5～15 min, 20%B; 15～25 min, 35%B; 25～35 min, 50%B; 35～45 min, 65%B; 45～55 min, 80%B; 55～65 min, 95%B; 65～80 min, 5%B。流速:500 nL/min,檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm。

1.4 納升液相色譜系統(tǒng)的構(gòu)建與評(píng)價(jià)

1.4.1納升液相色譜系統(tǒng)的構(gòu)建

基于捕集柱進(jìn)樣的納升液相色譜系統(tǒng)如圖1所示。進(jìn)樣系統(tǒng)由兩個(gè)切換閥組成,兩位六通閥處于虛線(xiàn)位時(shí)樣品進(jìn)入定量環(huán),處于實(shí)線(xiàn)位時(shí)樣品從定量環(huán)被P230Ⅱ輸送至下一個(gè)切換閥。兩位十通閥采用雙捕集柱結(jié)構(gòu),虛線(xiàn)位時(shí)右捕集柱進(jìn)行樣品富集及在線(xiàn)除鹽,左捕集柱進(jìn)行樣品洗脫,實(shí)線(xiàn)位時(shí)兩個(gè)捕集柱狀態(tài)交換。由納升泵對(duì)富集樣品后的捕集柱進(jìn)行梯度洗脫,并在C18毛細(xì)管分離柱上進(jìn)行進(jìn)一步分離,最后進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。

圖 1 納升液相色譜系統(tǒng)流路示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the nano liquidchromatography system 1. P230Ⅱ high pressure constant flow pump; 2. two-position-six-port valve; 3. sample needle; 4. two-position-ten-port valve; 5. nano pump; 6. trap column; 7. capillary separation column; 8. mass spectrometry.

1.4.2納升液相色譜系統(tǒng)的評(píng)價(jià)

分析BSA酶解液的條件如下。利用兩位六通閥手動(dòng)進(jìn)樣1 μg BSA酶解液,捕集流速為3 μL/min,捕集時(shí)間為10 min。捕集結(jié)束后切換十通閥,由納升泵對(duì)捕集柱進(jìn)行梯度洗脫。捕集流動(dòng)相與納升泵梯度洗脫的流動(dòng)相A相同,為98%水+2%乙腈+0.1%甲酸,流動(dòng)相B為98%乙腈+2%水+0.1%甲酸。分離梯度條件為:0～30 min, 5%B～40%B; 30～40 min, 80%B; 40～45 min, 80%B～5%B; 45～60 min, 5%B。流速為500 nL/min。用LTQ XL質(zhì)譜儀檢測(cè)。

質(zhì)譜檢測(cè)條件:掃描范圍為m/z400～1 800,正離子掃描模式,噴霧電壓為1.5 kV,毛細(xì)管加熱溫度為200 ℃,歸一化碰撞能量為35%。

數(shù)據(jù)庫(kù)檢索方法:質(zhì)譜采集的原始文件通過(guò)pXtract轉(zhuǎn)換后,用Mascot(2.4.0版,MatrixScience公司)軟件對(duì)序列進(jìn)行檢索。參數(shù)設(shè)置:母離子質(zhì)量容差為0.5 Da;碎片離子質(zhì)量容差為1 Da;蛋白質(zhì)水解酶為T(mén)rypsin;最多允許2個(gè)漏切位點(diǎn);固定修飾為carbamidomethyl (C);可變修飾為oxidation (M)和acetyl (protein N-term)。

分析Hela細(xì)胞蛋白質(zhì)酶解液的條件如下。Hela細(xì)胞蛋白質(zhì)酶解液的進(jìn)樣量為1.25 μg。捕集條件同BSA。分離梯度條件為:0～50 min, 5%B～25%B; 50～65 min, 25%B～45%B; 65～70 min, 45%B～80%B; 70～80 min, 80%B; 80～90 min, 5%B。流速為600 nL/min。用Q Exactive質(zhì)譜儀檢測(cè)。

質(zhì)譜檢測(cè)條件:掃描范圍為300～2 000m/z,正離子掃描模式,噴霧電壓為2.0 kV,毛細(xì)管加熱溫度為250 ℃,歸一化碰撞能量為35%。

數(shù)據(jù)庫(kù)檢索方法:質(zhì)譜采集的原始文件利用Proteome Discoverer ver.2.1.1.21進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。參數(shù)設(shè)置:母離子質(zhì)量容差為20 ppm (10-6);碎片離子質(zhì)量容差為20 mDa;蛋白質(zhì)水解酶為T(mén)rypsin;最多允許2個(gè)漏切位點(diǎn);固定修飾為carbamidomethyl (C);可變修飾為oxidation (M)和acetyl (protein N-term)。

2 結(jié)果與討論

2.1 納升泵的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

為了實(shí)現(xiàn)納升流速下的穩(wěn)定輸液,選用了一種高精度直驅(qū)步進(jìn)電機(jī)作為泵頭內(nèi)柱塞桿的驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)。設(shè)計(jì)了一種專(zhuān)用夾頭[16],將電機(jī)與柱塞桿剛性連接,無(wú)其他傳動(dòng)機(jī)構(gòu),因此電機(jī)的運(yùn)動(dòng)精度能夠直接表現(xiàn)為柱塞桿的運(yùn)動(dòng)精度。電機(jī)的運(yùn)動(dòng)精度為每脈沖0.032 μm,最大推力為300 N,選用直徑2 mm的柱塞桿時(shí),理論上輸液精度為0.1 nL/脈沖,最大壓強(qiáng)為95.5 MPa。納升泵的整體設(shè)計(jì)基于注射泵的結(jié)構(gòu),圖2為結(jié)構(gòu)示意圖,圖3為裝置實(shí)物圖。泵頭上只設(shè)置一個(gè)流動(dòng)相出入口,取消了傳統(tǒng)的單向閥結(jié)構(gòu),輸液與吸液的狀態(tài)切換通過(guò)兩位十通閥實(shí)現(xiàn)。十通閥的4個(gè)孔用絲堵堵住,其余6個(gè)孔通過(guò)管路分別與兩個(gè)溶劑瓶、兩個(gè)壓力變送器以及混合三通的兩個(gè)入口相連。

圖 2 納升泵結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 2 Schematic diagram of the structureof the nano pump 1. pump head A; 2. pump head B; 3. pressure transmitter PA; 4. pressure transmitter PB; 5. mobile phase bottle A; 6. mobile phase bottle B; 7. two-position-ten-port valve; 8. mix tee.

圖 3 納升泵實(shí)物圖Fig. 3 Photograph of the real nano pump

當(dāng)納升泵對(duì)外輸液時(shí),兩個(gè)泵頭輸出的流動(dòng)相經(jīng)過(guò)各自的壓力變送器進(jìn)入兩位十通閥,并通過(guò)十通閥的內(nèi)部通道進(jìn)入混合三通。由于此狀態(tài)下連接兩個(gè)溶劑瓶的管路在兩位十通閥處與絲堵相通,因此溶劑瓶及管路中的液體不會(huì)自發(fā)流動(dòng)。當(dāng)納升泵吸液時(shí),兩位十通閥切換狀態(tài),此時(shí)A、B溶劑瓶的管路在兩位十通閥處分別與A、B壓力變送器相通,泵頭內(nèi)由于柱塞桿向后運(yùn)行形成了負(fù)壓,使溶劑瓶中的流動(dòng)相被吸入泵頭中,實(shí)現(xiàn)對(duì)泵頭流動(dòng)相的補(bǔ)充,完成吸液。同時(shí),與混合三通入口相連的兩個(gè)管路在十通閥處與絲堵相通,因此能夠在一定程度上減小混合三通出口外系統(tǒng)的壓力突變,防止因系統(tǒng)壓力突變引起的色譜柱柱床損傷。

通常情況下,梯度輸液泵需要在兩相接觸的三通之后連接混合器以提高混合效果,但在納升流速條件下,常規(guī)的混合器結(jié)構(gòu)均會(huì)帶來(lái)明顯的梯度延遲,甚至可能因?yàn)榛旌象w積過(guò)大,導(dǎo)致無(wú)法實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的梯度輸液。本文所研制的納升泵采用三通直接混合的方式,以三通的中心作為混合區(qū)域,利用流動(dòng)相的分子擴(kuò)散和局部渦流實(shí)現(xiàn)納升流速下的流動(dòng)相混合,減小了梯度延遲。

2.2 納升泵的性能評(píng)價(jià)

2.2.1納升泵流速測(cè)試

常規(guī)的毫升級(jí)流速測(cè)量可使用質(zhì)量法或體積法,即測(cè)量一段時(shí)間內(nèi)流出的液體質(zhì)量或體積來(lái)計(jì)算輸出流速,但對(duì)于納升級(jí)的流速來(lái)說(shuō),這兩種方法均不適合。實(shí)驗(yàn)所用的流速測(cè)量裝置是一種基于溫度傳感的瞬時(shí)微流量計(jì),與常規(guī)的質(zhì)量法或體積法不同,這種流量計(jì)能夠以較高的采樣頻率測(cè)量流體的瞬時(shí)流速,因此更適合用來(lái)測(cè)試輸液泵納升級(jí)輸出流速的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性[17]。在不同的設(shè)定流速下,A、B泵輸出的實(shí)際流速、相對(duì)誤差以及穩(wěn)定性RSD值如表1所示。測(cè)試結(jié)果表明,實(shí)際流速與設(shè)定流速的線(xiàn)性相關(guān)性良好,決定系數(shù)(R2)達(dá)到0.999 98。流速的相對(duì)誤差優(yōu)于1.71%,在常用流速500 nL/min條件下的相對(duì)誤差低于1%。流速穩(wěn)定性RSD值均優(yōu)于2.83%,在常用流速500 nL/min條件下的RSD值低于0.7%。說(shuō)明所構(gòu)建的納升泵瞬時(shí)輸液流速偏差小,穩(wěn)定性好,可以滿(mǎn)足納升級(jí)恒流輸液的要求。

表 1 納升泵不同流速條件下的相對(duì)誤差及穩(wěn)定性(RSDs)(n=300)

2.2.2納升泵耐壓測(cè)試

通常實(shí)驗(yàn)所用的毛細(xì)管色譜柱背壓一般都在20 MPa以下,但為了提高分離效率和分離度,使用更細(xì)粒徑的亞2 μm填料裝填毛細(xì)管柱或裝填更長(zhǎng)的毛細(xì)管柱是常用的手段,這會(huì)使色譜柱背壓顯著提高,因此需要輸液泵也能提供較高的輸液壓強(qiáng)。納升泵的壓力測(cè)試結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出,隨著柱塞的不斷運(yùn)動(dòng),系統(tǒng)的壓力逐漸升高,最終達(dá)到壓力變送器的最大測(cè)量值100 MPa。由于電機(jī)的額定參數(shù)一般會(huì)留出20%左右的余量以防止電機(jī)在超負(fù)荷下工作造成損壞,因此實(shí)測(cè)的最大輸液壓強(qiáng)高于理論計(jì)算值。此外,泵頭取消了單向閥結(jié)構(gòu),無(wú)需考慮閥球閥座超高壓下的密封性問(wèn)題,中心的兩位十通閥同樣具有100 MPa以上的耐壓能力,保證了所構(gòu)建納升泵的系統(tǒng)密封性良好,滿(mǎn)足超高壓下使用的需求。

圖 4 納升泵壓力測(cè)試結(jié)果Fig. 4 Pressure testing result of the nano pump

2.2.3納升泵梯度測(cè)試

梯度洗脫是液相色譜常用的分離方法,主要有線(xiàn)性梯度和臺(tái)階梯度兩種模式。對(duì)輸液泵進(jìn)行梯度測(cè)試能夠反映輸液泵梯度輸液的準(zhǔn)確性、梯度變化的均勻性和梯度延遲。

納升泵梯度測(cè)試的結(jié)果如圖5所示。圖5a中,線(xiàn)性梯度3次測(cè)試的重復(fù)性良好,梯度線(xiàn)性階段變化均勻。在流動(dòng)相比例開(kāi)始發(fā)生變化時(shí),B相的流速極低,只有每分鐘幾納升的瞬時(shí)流速,但梯度曲線(xiàn)中并未發(fā)現(xiàn)梯度突變,這表明低比例下B相的輸液流速基本能夠均勻變化,進(jìn)一步驗(yàn)證了直驅(qū)電機(jī)的運(yùn)動(dòng)精度能夠滿(mǎn)足納升流速輸液的需求。梯度延遲體積大約在0.7 μL左右,這部分體積可能是由混合三通的混合處、三通至檢測(cè)池的連接管路、接頭等共同組成。采用流動(dòng)相比例分段變化的臺(tái)階梯度可以得到輸液泵的梯度準(zhǔn)確性信息,在圖5b的臺(tái)階梯度測(cè)試結(jié)果中,根據(jù)各臺(tái)階的平均信號(hào)值,計(jì)算得到梯度比例偏差在1%以?xún)?nèi)(見(jiàn)表2)。

圖 5 (a)線(xiàn)性(3次)與(b)臺(tái)階梯度測(cè)試結(jié)果Fig. 5 Results of (a) linear gradient (3 times)and (b) step gradient

表 2 臺(tái)階梯度準(zhǔn)確性(n=3)

2.3 納升液相色譜系統(tǒng)的評(píng)價(jià)

BSA是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的評(píng)價(jià)物質(zhì),多用來(lái)評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)酶解效率或分析裝置的性能[18,19]。根據(jù)圖1構(gòu)建納升液相色譜系統(tǒng),將1 μg BSA酶解液進(jìn)樣分離,得到一級(jí)譜的基峰色譜圖。如圖6所示,從圖中可以看出色譜峰的分布比較均勻,從9 min至37 min均有肽段被檢測(cè)出來(lái)。數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果表明,圖6中BSA的蛋白質(zhì)序列覆蓋率可達(dá)45%,與文獻(xiàn)[18,19]結(jié)果相當(dāng)。

圖 6 BSA酶解液的基峰色譜圖Fig. 6 Base peak chromatogram of the bovine serumalbumin (BSA) digests

Hela細(xì)胞是一種宮頸癌細(xì)胞,廣泛應(yīng)用于腫瘤研究、分子生物學(xué)研究或細(xì)胞培養(yǎng)研究。因其細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)種類(lèi)繁多,可用于評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)提取方法、酶解方法、蛋白質(zhì)組分析方法或質(zhì)譜儀器的性能[20,21]。將1.25 μg Hela細(xì)胞蛋白質(zhì)酶解液進(jìn)樣分離,得到如圖7所示的一級(jí)譜基峰色譜圖。對(duì)質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,共匹配到2 809個(gè)蛋白質(zhì),與文獻(xiàn)[20,21]中鑒定的數(shù)目相當(dāng)。通過(guò)BSA酶解液與Hela細(xì)胞蛋白質(zhì)酶解液的分離分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),所構(gòu)建的納升液相色譜系統(tǒng)能夠應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)的分析研究中。

圖 7 Hela細(xì)胞蛋白質(zhì)酶解液的基峰色譜圖Fig. 7 Base peak chromatogram of the Hela cell digests

3 結(jié)論

利用高精度直驅(qū)步進(jìn)電機(jī)和兩位十通閥研制了一種能夠以納升流速進(jìn)行梯度輸液的色譜輸液泵。通過(guò)流速準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性測(cè)試,表明該納升泵能夠以極高的流速精度進(jìn)行納升流速穩(wěn)定輸液,梯度偏差低于1%,流速準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性均可達(dá)到商品化儀器的水平。納升泵的耐壓能夠達(dá)到100 MPa,可用于納升超高效液相色譜系統(tǒng)中。進(jìn)一步利用該納升泵構(gòu)建納升液相色譜系統(tǒng),通過(guò)對(duì)BSA酶解液和Hela細(xì)胞蛋白質(zhì)酶解液進(jìn)行分離分析和鑒定,得到與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相近的序列覆蓋率和蛋白質(zhì)鑒定數(shù)目。說(shuō)明所研制的納升輸液泵能夠滿(mǎn)足蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用的輸液要求。

圖 1液相色譜系統(tǒng)流路結(jié)構(gòu)示意圖
1. 系統(tǒng)組織器; 2. 高壓恒流泵; 3. 自動(dòng)進(jìn)樣器; 4. 柱溫箱;
5. 檢測(cè)器.

圖 2多肽類(lèi)樣品分析譜圖
流動(dòng)相: 乙腈-水(均含0.1%(v/v, 下同)三氟乙酸), 梯度洗 脫(0～5 min, 20%乙腈; 5～20 min, 20%～90%乙腈; 20～30 min, 90%乙腈; 30～30.1 min, 90%～20%乙腈); 流速: 0.8 mL/min; 檢測(cè)波長(zhǎng): 214 nm; 進(jìn)樣量: 20 μL; 柱溫: 40 ℃.
1. 樣品峰; 2. 異常峰.