混合型離子交換液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中5種氨基糖苷類抗生素殘留

吳云輝,嚴(yán)麗娟,沈鷺英,林立毅,張 峰,徐敦明*

(1. 廈門海關(guān)檢驗檢疫技術(shù)中心, 福建 廈門 361026; 2. 廈門海洋職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 福建 廈門 361100;3. 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院, 北京 100176)

氨基糖苷類抗生素(aminoglycosides, AGs)可以有效抑制細(xì)菌的生長和繁殖,在臨床上用于治療綠膿桿菌、革蘭氏陰性菌感染,在農(nóng)業(yè)上也被作為動物促生長劑添加到飼料中。AGs具有廣譜抗菌特性,但其具有明顯的副作用,比如神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)阻滯,腸道功能損害以及耳毒性、腎毒性等,并且AGs會在生物組織中富集,殘留時間較長。如果消費(fèi)者食用了AGs殘留超標(biāo)的食品,可能會對身體健康造成危害。歐盟已經(jīng)明確禁止將AGs作為畜禽促生長添加劑使用,而近年來我國也對AGs在動物源食品中的殘留進(jìn)行了嚴(yán)格控制。在我國,蜂農(nóng)常不科學(xué)地使用AGs防治蜜蜂幼蟲病,導(dǎo)致蜂產(chǎn)品中AGs殘留超標(biāo)事件時有發(fā)生。因此,加強(qiáng)蜂產(chǎn)品中AGs殘留的監(jiān)控具有非常重要的現(xiàn)實意義。

AGs的主要結(jié)構(gòu)包括氨基糖和堿性1,3-二氨基肌醇,二者通過苷鍵連接。由于1,3-二氨基肌醇具有堿性多元環(huán)己醇結(jié)構(gòu),AGs通常具有較強(qiáng)的堿性和極性,在普通反相色譜柱上沒有保留。傳統(tǒng)方法通常在流動相或者進(jìn)樣溶液中加入離子對試劑,如七氟丁酸等,以改善液相色譜的分離效果[1-6]。但是,離子對試劑對質(zhì)譜檢測器的影響較大,特別是離子抑制和離子源污染問題。除了離子對色譜法,親水液相色譜色譜法(HILIC)也得到了較為廣泛的應(yīng)用,其原理是通過在流動相中加入緩沖鹽(如甲酸銨等)以增強(qiáng)AGs在色譜柱上的保留,從而與雜質(zhì)進(jìn)行較好的分離[7-14]。

目前,AGs的分離檢測仍然是獸藥殘留檢測領(lǐng)域的難點(diǎn)之一,混合保留模式可能是解決這一問題較理想的方法?；旌闲碗x子交換液相色譜柱,對于極性化合物的分離具有很好的效果,到目前為止已被成功應(yīng)用于各類動物源性食品(水產(chǎn)品和肉制品等)中AGs殘留的分析[15-17]。

本文采用分子印跡固相萃取柱凈化,混合型離子交換液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行分離檢測,全程不添加離子對試劑,建立了同時測定蜂蜜中5種氨基糖苷類抗生素的方法。該方法具有選擇性好、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),且對質(zhì)譜儀無污染,適用于蜂蜜中鏈霉素、雙氫鏈霉素、壯觀霉素、卡那霉素和阿米卡星等5種氨基糖苷類抗生素的檢測,對于控制抗生素在蜜蜂養(yǎng)殖業(yè)中的使用、保障蜂蜜質(zhì)量安全具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司); QTRAP 6500三重四極桿-線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜儀,配有電噴霧電離(ESI)源(美國AB SCIEX公司);Allegra 64R型高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司); 12通道半自動固相萃取裝置、SupelMIP Aminoglycosides分子印跡固相萃取柱(50 mg/3 mL(美國Supelco公司);旋渦混合器(德國IKA公司); Obelisc R色譜柱(100 mm×2.1 mm, 5 μm,美國SIELC公司)。

鏈霉素、雙氫鏈霉素、壯觀霉素、卡那霉素和阿米卡星等5種氨基糖苷類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司,純度均大于94%。甲酸、氨水、乙腈和甲醇均為色譜純;二氯甲烷、磷酸、磷酸氫二鉀均為分析純。實驗用水由Milli-Q系統(tǒng)(美國Millipore公司)制得。

50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.0)的配制:稱取8.7 g磷酸氫二鉀,加入950 mL水溶解,用磷酸調(diào)節(jié)pH值至8.0,用水定容至1 L。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品,分別用水溶解并定容,配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于4 ℃避光保存。吸取各標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用水稀釋成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于4 ℃避光保存。以空白基質(zhì)溶液將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋至適當(dāng)濃度,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

1.3.1提取

稱取2 g(精確至0.01 g)蜂蜜樣品,置于50 mL塑料離心管中,加入5 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)溶液,充分渦旋混合3 min后,以9 000 r/min離心5 min,收集上清液，待凈化。

1.3.2凈化

SupelMIP Aminoglycosides分子印跡固相萃取柱依次用3 mL甲醇和3 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.0)活化,然后將提取液全部過柱,控制上樣流速小于1 mL/min,棄去流出液。依次以3 mL水和1 mL 0.1%(v/v)氨水淋洗,真空抽干5 min,再用1 mL乙腈-水(40∶60, v/v)溶液淋洗,然后真空抽干10 s,再用1 mL二氯甲烷-甲醇(50∶50, v/v)溶液淋洗,然后真空抽干10 s,整個淋洗過程控制流速小于1 mL/min。最后用1.0 mL乙腈-水(20∶80, v/v)溶液(含5%(v/v)甲酸)洗脫至塑料管中,控制洗脫流速小于0.5 mL/min,收集洗脫液,經(jīng)0.22 μm尼龍濾膜過濾至2 mL塑料進(jìn)樣瓶中,供混合型離子交換液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.4 分析條件

1.4.1液相色譜條件

一些高職院校在開設(shè)旅游專業(yè)時，并沒有相應(yīng)的師資力量作為基本保障，所以不少院校通過掛靠在不同院系下進(jìn)行招生，這種情況很容易出現(xiàn)課程設(shè)置不合理的問題。課程設(shè)置不科學(xué)不合理就會導(dǎo)致學(xué)生難以形成一個完整的旅游專業(yè)知識體系，這在一定程度上脫離了高職教育的基本目的，不僅影響到旅游專業(yè)畢業(yè)生的就業(yè)，還嚴(yán)重制約了學(xué)生的進(jìn)一步發(fā)展。

色譜柱:Obelisc R色譜柱(100 mm×2.1 mm, 5 μm);柱溫:35 ℃;流速:0.4 mL/min;流動相:(A)0.1%(v/v)甲酸水溶液和(B)乙腈;梯度洗脫程序:0～2.0 min, 95%B; 2.0～5.0 min, 95%B～65%B; 5.0～8.0 min, 65%B～5%B; 8.0～14.0 min, 5%B; 14.0～14.1 min, 5%B～95%B; 14.1～20.0 min, 95%B。進(jìn)樣量:10 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧電離源;掃描方式:正離子掃描;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;電噴霧電壓(IS): 5 500 V;離子源溫度(TEM): 550 ℃;霧化氣壓力(GS1): 345 kPa;輔助氣壓力(GS2): 345 kPa;氣簾氣壓力(CUR): 241 kPa;碰撞氣壓力(CAD)模式:中度(medium);入口電壓(EP): 10 V;出口電壓(CXP): 10 V;滯留時間(dwell time): 20 ms。5種氨基糖苷類藥物的監(jiān)測離子對、聚焦電壓(DP)、碰撞能量(CE)見表1。

表 1 5種氨基糖苷類抗生素的質(zhì)譜參數(shù)

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

氨基糖苷類抗生素具有堿性,且極性較大,普通的C18反相固相萃取小柱難以將其保留。本實驗選擇了具有分子印跡功能的SupelMIP Aminoglycosides固相萃取柱,該固相萃取柱是由高度交聯(lián)的聚合物組成,在聚合物合成中引入模板分子,可選擇性地吸附與模板分子結(jié)構(gòu)類似的分析物,因此具有極高的選擇性,可有效降低基質(zhì)干擾,從而獲得較低的檢出限。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),采用分子印跡固相萃取柱萃取后,5種氨基糖苷類藥物的回收率均在85%以上,并且因為分子印跡固相萃取柱的選擇性較好,只有具有氨基糖苷類似結(jié)構(gòu)的目標(biāo)化合物才能被洗脫,因此對樣品凈化具有較好的效果。

采用SupelMIP Aminoglycosides固相萃取柱凈化時有推薦的活化、淋洗、洗脫方法,推薦的洗脫液為1 mL乙腈-水(20∶80, v/v)溶液(含5 mmol/L七氟丁酸和1%(v/v)甲酸)。實驗對該洗脫液進(jìn)行了優(yōu)化,不添加離子對試劑七氟丁酸,同時改變甲酸的體積分?jǐn)?shù),比較了洗脫液中含1%、2%、5%和10%(v/v)甲酸時目標(biāo)化合物的回收率。實驗發(fā)現(xiàn)。當(dāng)洗脫液中甲酸的體積分?jǐn)?shù)為1%或2%時,只能洗脫部分氨基糖苷類藥物,回收率在40%以下;而當(dāng)洗脫液中甲酸的體積分?jǐn)?shù)≥5%時,5種氨基糖苷類藥物可被洗脫,回收率均大于85%。因此,本實驗選擇乙腈-水(20∶80, v/v)溶液(含5%(v/v)甲酸)作為洗脫溶液。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在優(yōu)化條件下,5種氨基糖苷類抗生素基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 μg/L)的MRM色譜圖見圖1。

圖 1 5種氨基糖苷類抗生素基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(20μg/L)的MRM色譜圖Fig. 1 MRM chromatograms of the five aminoglycosides in a matrix matching mixed standard solution (20μg/L)

2.3 色譜條件的優(yōu)化

由于氨基糖苷類藥物的極性較強(qiáng),采用普通的反相色譜柱沒有保留,通常需要在流動相中加入離子對試劑,化合物才能獲得較好的保留。在不添加離子對試劑的情況下,通常采用親水作用色譜柱進(jìn)行分離,不同色譜柱因固定相種類不同,色譜保留機(jī)理存在一定差異[8,11]。Obelisc R色譜柱具有混合型離子交換色譜的機(jī)理,分析物與色譜柱固定相存在離子交換的作用機(jī)制,即在酸性條件下,堿性物質(zhì)呈陽離子狀態(tài),在固定相上的吸附能力較強(qiáng),保留較強(qiáng)。由于鏈霉素、雙氫鏈霉素、壯觀霉素、卡那霉素和阿米卡星等5種氨基糖苷類抗生素的pKa均大于7,為強(qiáng)堿性化合物,當(dāng)緩沖液pH小于pKa時,化合物以離子形式存在。實驗分別采用體積分?jǐn)?shù)為0.1%、0.5%和1%的甲酸水溶液和乙腈作為流動相,考察甲酸的體積分?jǐn)?shù)對色譜分離的影響。實驗發(fā)現(xiàn),隨著甲酸體積分?jǐn)?shù)的增大,5種抗生素的保留時間縮短,但是峰形變差,特別是壯觀霉素的色譜峰出現(xiàn)分叉,所有化合物的靈敏度均降低。因此最后選取0.1%(v/v)甲酸水溶液和乙腈作為流動相,5種氨基糖苷類抗生素在Obelisc R色譜柱上可獲得滿意的保留和峰形。

2.4 線性范圍和定量限

取空白蜂蜜基質(zhì)溶液,加入系列已知量的氨基糖苷類藥物,配制鏈霉素和雙氫鏈霉素質(zhì)量濃度分別為5、10、20、50和100 μg/L,壯觀霉素、卡那霉素和阿米卡星質(zhì)量濃度分別為20、50、100、250和500 μg/L的系列基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后進(jìn)行測定,以定量離子的響應(yīng)峰面積(y)對相應(yīng)的質(zhì)量濃度(x, μg/L)進(jìn)行線性回歸。

實驗結(jié)果表明,5種氨基糖苷類藥物在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)定量離子的響應(yīng)峰面積和樣品濃度間具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.998(見表2)。

表 2 5種氨基糖苷類抗生素的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和定量限

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

以不含待測組分的蜂蜜為空白基質(zhì)樣品,采用空白樣品添加目標(biāo)化合物的方法,按照1.3節(jié)和1.4節(jié)步驟處理,以特征離子色譜峰的信噪比(S/N)≥10為方法的定量限,計算5種氨基糖苷類抗生素的定量限。鏈霉素和雙氫鏈霉素的定量限為5 μg/kg,壯觀霉素、卡那霉素和阿米卡星的定量限為20 μg/kg。文獻(xiàn)[8]采用Merck ZIC-HILIC色譜柱對蜂蜜中氨基糖苷類藥物進(jìn)行分析,其中這5種氨基糖苷類藥物的定量限為7～34 μg/kg。除壯觀霉素外,本實驗分析的其他4種化合物的定量限均優(yōu)于文獻(xiàn)方法。

2.5 回收率和精密度

分別向空白蜂蜜樣品中添加1倍、2倍和5倍定量限水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個添加水平取6個平行樣品,按1.3節(jié)和1.4節(jié)描述進(jìn)行處理和測定,計算各個添加水平的回收率和精密度。

由表3可以看出,5種氨基糖苷類藥物的平均回收率為75.1%～92.3%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.5%～10.7%,表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度,能夠滿足日常檢測的分析要求。

2.6 實際樣品分析

采用本方法對市售的15份蜂蜜樣品進(jìn)行檢測,均未檢出鏈霉素、雙氫鏈霉素、壯觀霉素、卡那霉素和阿米卡星等5種氨基糖苷類抗生素。

表 3 蜂蜜樣品中5種氨基糖苷類抗生素的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

3 結(jié)論

本文建立了混合型離子交換液相色譜-電噴霧電離三重四極桿-線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜測定蜂蜜中鏈霉素、雙氫鏈霉素、壯觀霉素、卡那霉素和阿米卡星等5種氨基糖苷類抗生素的檢測方法。本方法簡便快速,線性范圍寬,定量限低,重復(fù)性好,全程不添加離子對試劑,有效避免了對質(zhì)譜儀的污染,各項技術(shù)指標(biāo)均能滿足日常檢測的分析要求,可用于蜂蜜中5種氨基糖苷類抗生素的測定。