GeneXpert MTB/RIF在結(jié)核性心包炎診斷及利福平耐藥檢測中的應(yīng)用

胡 旭，邢寶春

(河南省胸科醫(yī)院內(nèi)五科，鄭州 450000)

據(jù)WHO統(tǒng)計，結(jié)核(tuberculosis,TB)是全球人口十大死因之一，肺外結(jié)核(extrapulmonary TB,EPTB)占全部結(jié)核的15%，且發(fā)病率不斷增加[1]。結(jié)核性心包炎是EPTB的一種，是引起發(fā)展中國家人口心包積液和縮窄性心包炎的最常見病因，病死率高達(dá)17%～40%，因此早期診斷和治療十分重要[2]。心包積液中含菌量少，細(xì)菌培養(yǎng)和微生物學(xué)檢驗的靈敏度低，結(jié)核性心包炎的診斷仍然面臨挑戰(zhàn)[3]。早期開始抗TB治療可以降低結(jié)核性心包炎的病死率，因此，臨床快速準(zhǔn)確地診斷十分重要。

GeneXpert MTB/RIF是一種全自動半巢式實時聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)系統(tǒng)，可以在3 h內(nèi)快速診斷TB和利福平(RIF)耐藥[4]。2010年WHO開始推薦使用Xpert MTB/RIF方法，并在2013年更新了官方指導(dǎo)：Xpert MTB/RIF試驗或許可以代替采用非呼吸標(biāo)本診斷肺外結(jié)核的常用方法(傳統(tǒng)鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)或組織病理學(xué)檢查)。許多研究將Xpert應(yīng)用于EPTB，如淋巴結(jié)結(jié)核[5]、泌尿系結(jié)核[6]、結(jié)核性胸膜炎[7]和結(jié)核性腦膜炎[8]，并取得了較好的診斷效能。Xpert在結(jié)核性心包炎的診斷價值研究極少，國內(nèi)尚無將Xpert應(yīng)用于結(jié)核性心包炎的研究。本研究將評價GeneXpert MTB/RIF在結(jié)核性心包炎診斷及RIF耐藥檢測中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 連續(xù)收集2015年8月至2017年2月在河南省胸科醫(yī)院住院治療的疑似結(jié)核性心包炎患者資料。入組標(biāo)準(zhǔn)：大量心包積液(在舒張期超聲檢查心臟周邊無回聲區(qū)大于10 mm)；年齡大于18周歲；簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：懷孕；心包穿刺前抗結(jié)核治療超過1周；拒絕簽署知情同意書或無行為能力。最終190例患者入組，且研究獲得本院倫理委員會審核通過。

1.2標(biāo)本獲取及處理 患者心包穿刺或心包活檢由臨床醫(yī)師操作，至少獲取50 mL心包積液。所獲得的心包積液標(biāo)本及心包活檢標(biāo)本送本院檢驗科。心包積液行常規(guī)生化分析、涂片染色鏡檢、BACTEC MGIT 960系統(tǒng)液體培養(yǎng)和GeneXpert MTB/RIF檢測。挑選培養(yǎng)陽性的菌株進(jìn)行藥敏試驗和菌株鑒定。標(biāo)本-20 ℃儲存。

1.3涂片鏡檢 按標(biāo)準(zhǔn)操作[9]，吸取0.05～0.1 mL標(biāo)本，涂抹10 mm×20 mm大小，每份標(biāo)本涂抹2張涂片，抗酸染色后使用熒光顯微鏡鏡檢抗酸桿菌。

1.4細(xì)菌培養(yǎng) 采用NaOH-乙酰半胱氨酸法進(jìn)行去污染處理。液體培養(yǎng)按照MGIT 960系統(tǒng)操作說明書進(jìn)行。出現(xiàn)陽性結(jié)果后，取培養(yǎng)液涂片使用快速抗酸染色進(jìn)行確認(rèn)，染色陽性菌株使用傳統(tǒng)培養(yǎng)法鑒定桿菌類型。

1.5藥敏試驗 按BACTEC MGIT960系統(tǒng)中利福平藥敏試驗操作說明進(jìn)行。藥物作用濃度為1 mg/L，該方法作為藥敏試驗結(jié)果的參考。

表1 入組患者基線資料

1.6菌型鑒定 按標(biāo)準(zhǔn)操作[10]，取陽性菌株培養(yǎng)液0.1 mL分別接種于含PNB和TCH的羅氏培養(yǎng)管中，36 ℃培養(yǎng)4周，TCH陽性、PNB陰性為結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)，TCH陽性、PNB陽性為非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculosis mycobacteria,NTM)。

1.7GeneXpert MTB/RIF 按WHO官方應(yīng)用指南中的肺外標(biāo)本標(biāo)準(zhǔn)處理流程進(jìn)行。將10 mL心包積液標(biāo)本離心(3 000 r/min,15 min)，移除上清液，加入Xpert樣本試劑充分懸浮沉淀至2 mL，后移入Xpert反應(yīng)盒中，按照廠家說明裝載入儀器中。自動化檢測結(jié)束后在檢測系統(tǒng)可觀察測試結(jié)果，不確定的結(jié)果不進(jìn)入數(shù)據(jù)分析。

1.8診斷分組 通過細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果、心包活檢病理結(jié)果、心包積液常規(guī)生化分析結(jié)果、抗結(jié)核治療效果進(jìn)行診斷分類。TB確診：固體或液體細(xì)菌培養(yǎng)陽性(心包積液標(biāo)本或非心包積液標(biāo)本)和(或)心包組織病理為肉芽腫性炎癥。臨床TB：不滿足TB確診標(biāo)準(zhǔn)，但臨床表現(xiàn)高度可疑(癥狀、影像學(xué)、心包積液常規(guī)生化分析)，抗結(jié)核治療有效。TB確診和臨床TB為TB組。非TB組：無TB微生物學(xué)證據(jù)，診斷為其他疾病。

表2 Xpert、涂片鏡檢和細(xì)菌培養(yǎng)在結(jié)核性心包炎中的診斷結(jié)果(%)

2 結(jié) 果

2.1患者入組情況和基線資料 190例患者連續(xù)入組，排除10例患者，其中5例培養(yǎng)污染(2.6%)，2例為非結(jié)核分枝桿菌感染(1.1%)，3例Xpert結(jié)果不確定(1.6%)。最后納入結(jié)果分析共180例，其中14例為TB確診(7.8%)，38例為臨床TB(21.1%)，TB組共52例(28.9%)，非TB組共128例(71.1%)，患者基線資料見表1。

2.2Xpert診斷結(jié)果 將細(xì)菌培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert的靈敏度為78.6%，特異度為85.5%，PPV為31.4%，NPV為97.9%。只有1例TB確診的患者心包積液涂片鏡檢陽性，涂片鏡檢靈敏度為7.1%，低于Xpert(χ2=14.583,P<0.01)，特異度為100.0%，高于Xpert(χ2=25.870,P<0.01)。臨床TB結(jié)果聯(lián)合細(xì)菌培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)(復(fù)合參考標(biāo)準(zhǔn))，Xpert的靈敏度為65.4%，特異度為99.2%，PPV為97.1%，NPV為87.6%。細(xì)菌培養(yǎng)靈敏度為26.9%，特異度為100.0%。細(xì)菌培養(yǎng)的靈敏度低于Xpert，(χ2= 15.467,P<0.01)，特異度與Xpert比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.004,P=0.316)。涂片鏡檢靈敏度為2.0%，低于Xpert(χ2=46.897,P<0.01)及細(xì)菌培養(yǎng)(χ2= 13.166,P<0.01)，特異度為100.0%，與Xpert比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.004,P=0.316)。在TB確診患者，Xpert共檢測出6例RIF耐藥患者，其中5例與藥敏試驗一致，靈敏度為100.0%;另1例Xpert檢驗RIF耐藥，藥敏試驗顯示敏感，后經(jīng)臨床用藥證實為RIF耐藥。在臨床TB患者，Xpert共檢測出15例RIF耐藥患者，復(fù)合標(biāo)準(zhǔn)下RIF耐藥率為40.4%(21/52)，見表2。

3 討 論

WHO認(rèn)為Xpert MTB/RIF試驗或許可以代替采用非呼吸標(biāo)本診斷肺外結(jié)核的常用方法，并已推薦作為可疑結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液的首選檢查。在RIF耐藥檢測方面，WHO認(rèn)為陰性的Xpert MTB/RIF結(jié)果可以排除RIF耐藥，且無需進(jìn)一步試驗證實。在我國，高感染率、高患病率和高耐藥率，認(rèn)知率、發(fā)現(xiàn)率和服藥依從性差，患病率下降緩慢等構(gòu)成結(jié)核病的流行特點(diǎn)[11]，因此在國內(nèi)積極開展GeneXpert MTB/RIF檢測應(yīng)用及研究十分必要。本研究表明Xpert在心包積液標(biāo)本中的表現(xiàn)優(yōu)于涂片鏡檢和液體細(xì)菌培養(yǎng)。

本研究中，28.9%(52/180)的心包積液患者診斷為結(jié)核性心包炎。BIAN 等[12]發(fā)現(xiàn)在75例可疑結(jié)核性心包炎患者中，24例(32%)患者診斷為結(jié)核，MA 等[13]發(fā)現(xiàn)在140例中國漢族中等及大量心包積液的患者中，40例(28.6%)為結(jié)核性，與本研究結(jié)果一致。

Xpert MTB/RIF診斷肺外結(jié)核病的靈敏度報道不一，從25%到96.6%不等，但大多都超過50%。肺外標(biāo)本多樣、含菌量低且獲取困難，同時標(biāo)本預(yù)處理不同以及參考金標(biāo)準(zhǔn)的不一致，導(dǎo)致了Xpert用于肺外結(jié)核病的研究比較復(fù)雜。BAHR等[14]發(fā)現(xiàn)使用較大的腦脊液量離心后Xpert靈敏度為72%，接近培養(yǎng)法的71%，而使用2 mL未離心的腦脊液則只有28%的靈敏度。本研究采用10 mL心包積液標(biāo)本進(jìn)行離心濃縮處理，取得了較好診斷準(zhǔn)確度，且Xpert不確定結(jié)果數(shù)量較少(3/190,1.6%)。有研究將心包積液標(biāo)本(20 mL)離心處理后并未有效地增加診斷準(zhǔn)確度，反而增加了不確定結(jié)果的數(shù)量(10.4%)。筆者認(rèn)為可能是由于較大量的心包積液離心形成了較多的血細(xì)胞團(tuán)塊以及滲出炎癥蛋白，從而造成PCR反應(yīng)失敗。因此10 mL的標(biāo)本量或許值得推薦，BAHR等[15]同樣推薦8～10 mL腦脊液并進(jìn)行離心處理用于Xpert，但最佳的標(biāo)本量仍需進(jìn)一步研究。

本研究中，以細(xì)菌培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert的靈敏度為78.6%，特異度為85.5%。SAEED等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)時，心包積液的Xpert靈敏度為72.2%，與本研究相似。由于肺外標(biāo)本含菌量低，培養(yǎng)不是最佳的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究聯(lián)合了細(xì)菌培養(yǎng)和臨床診斷TB作為復(fù)合參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步評價Xpert的診斷效能，因此結(jié)果可能會更加精確。以復(fù)合參考標(biāo)準(zhǔn)為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert診斷靈敏度為65.4%，高于細(xì)菌培養(yǎng)和涂片鏡檢。

本研究中Xpert在心包積液的診斷效能優(yōu)于其他研究。本研究取得較高的診斷效能可能源于較少的病例數(shù)、合適的標(biāo)本量(10 mL)及未進(jìn)行去污染處理，一定程度上避免了菌量的丟失及血細(xì)胞和炎性蛋白的干擾。VADWAI 等[17]分析了3例心包積液Xpert結(jié)果，取得了100%的靈敏度，因而存在較大偏差。血性或者黃色腦脊液標(biāo)本可能會導(dǎo)致Xpert的假陰性結(jié)果，而本研究患者有較高比例的血性或黃色渾濁心包積液，可能影響了Xpert的診斷效能，研究消化炎性蛋白的方法或者加入合適的血細(xì)胞裂解液或許可以進(jìn)一步提升Xpert的診斷效能[18]。由于Xpert在結(jié)核性心包炎診斷中的應(yīng)用研究報道極少，本研究的診斷效能不一定普遍適用。

相對于復(fù)合參考標(biāo)準(zhǔn)，本研究細(xì)菌培養(yǎng)的靈敏度較低(26.9%)，可能下列原因有關(guān)：部分患者入組前接受了幾日的抗結(jié)核治療；肺外標(biāo)本含菌量低的特性使得結(jié)核分枝桿菌傾向于形成菌團(tuán)，培養(yǎng)時而無法均勻分布影響生長效能；NaOH-乙酰半胱氨酸法去污染處理的過程中會造成菌量的丟失。

本研究顯示河南地區(qū)TB耐藥率為40.4%，與國內(nèi)研究一致[19]。Xpert在RIF耐藥檢測方面靈敏度為100%，與普遍研究均一致。其中1例Xpert顯示RIF耐藥而藥敏試驗為敏感。在WHO指南中同樣指出Xpert試驗顯示部分耐RIF的結(jié)核菌株在藥敏試驗和耐藥表型檢測中為敏感，但通過DNA測序后通常都支持Xpert結(jié)果。本研究中該患者經(jīng)臨床一線藥物診治證實為耐藥，符合Xpert結(jié)果。

本研究發(fā)現(xiàn)GeneXpert MTB/RIF在結(jié)核性心包炎中取得了相對較好的診斷效能，但有研究發(fā)現(xiàn)Xpert的靈敏度低于其他方法，如T-SPOT、TB、IGRAs等。結(jié)核需要快速精確的診斷，聯(lián)合GeneXpert MTB/RIF與其他診斷方法，進(jìn)一步尋求最佳的診斷效能或許是下一步研究的方向。