銀芩膠囊HPLC指紋圖譜研究

1.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2.昆藥集團(tuán)股份有限公司，云南 昆明 650100

銀芩膠囊是在傣族“雅哇黃”方基礎(chǔ)上開發(fā)的現(xiàn)代制劑[1]，其主要由黃芩、金銀花、魚腥草、三七葉合理配伍而成，其內(nèi)容物為黃色至黃褐色顆粒和粉末，氣微、味苦。本品具有清熱解毒之功效，用于治療外感風(fēng)熱所致的發(fā)熱、咳嗽、咽痛及呼吸道感染、扁桃體感染和咽炎[2]。黃芩中黃酮及其苷類是其主要的藥效成分[3]，金銀花化學(xué)成分主要包括有機(jī)酸、黃酮類、三萜皂苷類、環(huán)烯醚萜類、揮發(fā)油及微量元素等，其中有機(jī)酸以綠原酸類化合物為主[1,4]。三七葉中富含皂苷類成分[5]。魚腥草中揮發(fā)類成分較多，非揮發(fā)性成分較少，非揮發(fā)性成分主要有槲皮苷、蘆丁、金絲桃苷等[6]。中藥復(fù)方制劑通常由多味藥組成，其中所包含的化學(xué)成分上百種，這給復(fù)方制劑的研究帶來一定的困難。中藥指紋圖譜[7]是一種綜合的、可量化的分析手段，是目前符合中藥特點(diǎn)、評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的控制模式之一。指紋圖譜能反映中藥制劑的整體特征，提高中藥復(fù)方制劑質(zhì)量控制的專屬性，在鑒別和評(píng)價(jià)藥品內(nèi)在質(zhì)量方面的作用遠(yuǎn)大于選擇一個(gè)指標(biāo)成分測(cè)定含量的作用[8-9]。因此更為科學(xué)和合理，也更符合中藥的多途徑協(xié)調(diào)作用的藥理特點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器與試藥 Waters RD.LC 高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Milli-Q 超純水器，Millipone 公司；XP 205分析電子天平，梅特勒-托利多公司；X Bridge C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)MUST-18010410,Purity 98.58%,HPLC)，中國科學(xué)院成都生物研究所；銀芩膠囊(批號(hào)：161009-01、161009-02、170605-01、170605-02、180401-01、180401-02、180206-01、180206-02、180307-01、180307-02)，昆藥集團(tuán)股份有限公司；

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 精密稱取芩膠囊內(nèi)容物0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加70%甲醇10 mL，超聲處理20 min(功率250 W，頻率350 Hz)，進(jìn)行提取兩次，再倒入10 mL離心管中離心15 min，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取黃芩苷對(duì)照品，加70%甲醇制成每1 mL中含100 μg的溶液，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱：X Bridge C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μ m)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，以表1中梯度洗脫條件洗脫；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長：280 nm；流速1.0 mL/min。

表1 梯度洗脫表

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 儀器精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣6次，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.3%，各共有峰相對(duì)峰面積<0.13%合指紋圖譜技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的要求，結(jié)果顯示方法的精密度好。見表2。

2.4.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批銀芩膠囊樣品，按“2.1”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<2.1%，各共有峰的相對(duì)峰面積RSD<0.12%。表明該方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜的測(cè)定要求。見表3。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，分別于0、6、12、24、36、48 h進(jìn)行指紋圖譜測(cè)定，測(cè)定各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.32%，各共有峰的相對(duì)峰面積RSD<0.89%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。見表4。

表2 銀芩膠囊共有峰精密度

注：4號(hào)峰(黃芩苷)為參照峰。

表3 銀芩膠囊共有峰重復(fù)性

注：4號(hào)峰(黃芩苷)為參照峰

表4 銀芩膠囊共有峰穩(wěn)定性

注：4號(hào)峰(黃芩苷)為參照峰。

2.5 指紋圖譜的建立及共有峰的標(biāo)記 分別制備10批昆藥集團(tuán)生產(chǎn)的銀芩膠囊供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖如圖1所示;各批銀芩膠囊指紋圖譜概貌一致，相似度值均大于0.98，總體相似度較高，見表5；選取8個(gè)共有峰作為特征指紋峰，建立銀芩膠囊對(duì)照指紋圖譜，如圖2所示。

分析十批銀芩膠囊HPLC色譜圖，峰4為黃芩苷，峰6為漢黃芩苷，峰7為黃芩素，峰8為漢黃芩素，其中峰4在色譜圖中分離效果較好，含量高，且為銀芩膠囊中藥的質(zhì)量控制指標(biāo)成分，故確定峰4黃芩苷為參照峰。

表5 十批銀芩膠囊指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

3 討論

3.1 固定相的選擇 本試驗(yàn)比較了不同廠家不同型號(hào)的3種色譜柱：①Ulatimate AQ C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；②LUNA C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);③X Bridge C-18(4.6 mm×250 mm,5 μm);結(jié)果表明色譜柱①的分離效果較差，黃芩苷未能和小峰分離，且峰形不好。色譜柱③的黃芩苷峰也未能達(dá)到分離；色譜柱②的分離效果均良好，故選擇X Bridge C18色譜柱。

3.2 流動(dòng)相體系的選擇 取同一供試品溶液，考察不同流動(dòng)相體系對(duì)色譜峰分離效果的影響，采用甲醇-水流動(dòng)相體系，因甲醇洗脫能力較弱，色譜峰峰形不好且出峰不完全。故考察了乙腈-水流動(dòng)相體系，乙腈-0.1%甲酸水流動(dòng)相體系、乙腈-0.1%乙酸水流動(dòng)相體系。試驗(yàn)過程中，采用梯度洗脫分離銀芩膠囊中的有效成分，結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水時(shí)，色譜峰出峰完全且峰形較好。故選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液。

3.3 梯度的選擇 取同一供試品溶液，分別考察了三個(gè)梯度洗脫條件對(duì)色譜峰分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)只有在表1梯度洗脫條件下，黃芩苷的峰能與其他小峰分開。因此選擇表1中的梯度條件進(jìn)行洗脫。

3.4 檢測(cè)波長的選擇 取同一供試品溶液，以表1中梯度洗脫條件洗脫，進(jìn)行檢測(cè)波長的選擇考察，取同一供試品溶液，測(cè)定某一特定成分含量的檢測(cè)波長通常不一定適合指紋圖譜的需要，為了獲得多層次的信息，需要選擇數(shù)個(gè)不同的檢測(cè)波長，同時(shí)銀芩膠囊為復(fù)方制劑，其所含化學(xué)成分較多。因此，在試驗(yàn)中應(yīng)使用PDA檢測(cè)器全波長檢測(cè)獲得3D指紋圖譜[10]。結(jié)果表明280 nm處可以得到較多的化學(xué)信息，故選擇280 nm作為檢測(cè)波長。

3.5 柱溫的選擇 取同一供試品溶液，考察不同色譜柱溫度(20 ℃、25 ℃、30 ℃)的色譜峰分離情況，測(cè)得三種不同溫度下色譜分離效果相似，因?yàn)?5 ℃接近室溫，最終確定25 ℃為測(cè)定用柱溫。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過供試品前處理方法的研究，色譜條件的研究，最終確定銀芩膠囊指紋圖譜的分析方法，因目前銀芩膠囊僅在昆藥集團(tuán)生產(chǎn)，因此產(chǎn)品批數(shù)較單一，后續(xù)還需大量樣品的質(zhì)量跟蹤，數(shù)據(jù)積累，初步暫定銀芩膠囊的指紋圖譜相似度在0.90以上為合格。本研究嘗試了多種不同梯度的洗脫條件，最終確定了銀芩膠囊的指紋圖譜分析的色譜條件，考察確定了8個(gè)共有峰的對(duì)照指紋圖譜，方法快速、簡便、重復(fù)性好，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證滿足其相關(guān)要求。本研究建立的一種銀芩膠囊的指紋圖譜分析方法適用性強(qiáng)，能夠全面反映產(chǎn)品的質(zhì)量狀況。