高機械指數(shù)超聲輻照微泡對結腸癌細胞影響的體外實驗研究

宋丹琳,鄭靜,孔健,李明偉,王洋,張海

結腸癌是臨床常見惡性腫瘤，GLOBOCAN估計我國男性、女性的結直腸癌發(fā)病率分別為16.9/10萬、11.6/10萬，死亡率分別為9.0/10萬、6.1/10萬[1]。遠處轉移是導致結腸癌高死亡率的主要原因之一[2]，腫瘤細胞的遠處轉移涉及侵襲及遷移能力的改變[3]，且與細胞骨架的形態(tài)分布密切相關[4]。近年報道顯示超聲輻照技術能夠提高結腸癌藥物治療效果[5]，但針對性分析超聲輻照技術對結腸癌細胞骨架及侵襲、遷移能力影響的報道較少，本研究以結腸癌Lovo細胞為對象，擬重點探討高機械指數(shù)超聲輻照微泡對結腸癌細胞骨架及侵襲、遷移能力的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

實驗材料：結腸癌Lovo細胞株，購自中科院上海生命科學研究院。主要試劑：DMEM培養(yǎng)基，購自美國Gibco；胎牛血清，購自杭州四季青；Hank液及胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)，購自美國Sigma；聲諾維造影劑，購自意大利Bracco；mytomycin C，購自美國selleck；Transwell小室，購自美國BD。主要儀器：Vivid 5型彩色多普勒超聲儀，購自美國GE；TCS-SP5激光共聚焦顯微鏡，購自德國Leica；BV51熒光顯微鏡，購自日本Olympas。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 從液氮中取出Lovo細胞，復蘇，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2、100%飽和濕度。隔天傳代1次，達到對數(shù)生長期后，用0.25%胰蛋白酶消化，制備為2×105個/mL單細胞懸液。

1.2.2 分組方法 擬將細胞分為空白對照組、超聲輻照組、微泡組及超聲輻照+微泡組，開展對照研究。

1.2.3 細胞遷移能力檢測 以每孔5×105/個細胞的密度，將Lovo細胞接種于6孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁后加入S期細胞周期阻滯劑mytomycin C，預處理1 h以抑制細胞生長。以10 μL移液槍頭在每個培養(yǎng)孔內劃一條直線，PBS洗去劃下的細胞，隨后加入無血清DMEM培養(yǎng)基(空白對照組及超聲輻照組)或50 μL/mL聲諾維含藥無血清DEME培養(yǎng)基(超聲輻照+微泡組及微泡組)，每組3孔。需要超聲輻照的兩組，調節(jié)超聲探頭頻率為1.5 MHz，機械指數(shù)1.7，顯像深度4 cm，用醫(yī)用膠帶將探頭環(huán)形纏繞，呈現(xiàn)一凹槽，在凹槽中加入耦合劑，使培養(yǎng)板與耦合劑充分接觸，超聲輻照6 s，間歇6 s，共20次。繼續(xù)培養(yǎng)，顯微鏡下觀察24 h各組細胞劃痕愈合情況，以Image-Pro Plus 6.0計算劃痕愈合率。

1.2.4 細胞侵襲能力檢測 在24孔板中加入600 μL含20%胎牛血清的DEME培養(yǎng)基，將Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)孔中按分組要求加入無血清DMEM培養(yǎng)基(空白對照組及超聲輻照組)或50 μL/mL聲諾維含藥無血清DEME培養(yǎng)基(超聲輻照+微泡組及微泡組)，每組3孔，然后將250 μL細胞懸液加入至Transwell小室中。需要超聲輻照的兩組參考細胞遷移能力檢測部分進行超聲輻照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以棉簽拭去小室內底部未遷移的細胞，4%甲醛固定小室外底部的細胞，染色后，觀察各組細胞穿過小室的細胞數(shù)目，取5個高倍鏡視野細胞數(shù)的均值。

1.2.5 細胞骨架形態(tài)檢測 在細胞復蘇培養(yǎng)時，參考細胞遷移能力檢測部分進行相關分組處理，待達到對數(shù)生長期后，用PBS漂洗，0.25%胰酶消化，制備為1×105個/mL單細胞懸液，以每孔2×105/個細胞的密度加入預先加有蓋玻片的6孔細胞培養(yǎng)板中，每組6孔，其中3孔用于檢測細胞微絲，3孔用于檢測細胞微管，24～48 h后，取出細胞爬片。用于細胞微管檢測的爬片，PBS洗2～3次，2%多聚甲醛固定20 min，再以0.5% Triton X-100+PBS洗3次，每次5 min；隨后加入山羊血清，封閉30 min，再以0.5% Triton X-100+PBS洗3次，每次5 min；隨后加入鼠抗人β-tubulin單克隆抗體為一抗，37 ℃下孵育90 min，在以0.5% Triton X-100+PBS洗3次，每次5 min；添加FITC標記的二抗，室溫孵育90 min，再以PBS洗3次，每次5 min；最后以緩沖甘油封片，鏡下觀察。用于細胞微絲觀察的爬片，1×PBS漂洗3次，每次5 min，2%多聚甲醛固定20 min，再以PBS洗3次，每次5 min；再以0.5% Triton X-100+PBS洗3次，每次5 min；隨后將爬片置于濕盒內，加入5 μg/mL FITC-phallodin，37 ℃孵育30 min，PBS洗4次，每次5 min；最后以緩沖甘油封片，鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 四組細胞遷移及侵襲能力對比

細胞劃痕實驗顯示超聲輻照+微泡組劃痕愈合率明顯低于其它三組(P<0.05)，超聲輻照組、微泡組及空白對照組劃痕愈合率對比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Transwell細胞侵襲實驗顯示超聲輻照+微泡組細胞侵襲數(shù)目明顯低于其它三組(P<0.05)，超聲輻照組、微泡組及空白對照組細胞侵襲數(shù)目對比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1、圖1、圖2。

表1 四組細胞遷移及侵襲能力對比

注：*與超聲輻照+微泡組對比，P< 0.05

圖1 四組細胞劃痕愈合結果 ①超聲輻照+微泡組；②超聲輻照組；③微泡組；④空白對照組

圖2四組細胞Tranwell侵襲實驗結果 ①超聲輻照+微泡組；②超聲輻照組；③微泡組；④空白對照組

2.2 四組細胞微管、微絲結構對比

超聲輻照組、微泡組、空白對照組微管染色表現(xiàn)均呈細胞致密的絲狀網(wǎng)絡結構，放射性延伸至細胞邊緣；超聲輻照+微泡組絲狀網(wǎng)絡結構稀疏，主要沿細胞長軸排列，見圖3；超聲輻照組、微泡組、空白對照組微絲染色均呈細胞致密網(wǎng)絡狀細絲結構，向四周伸出大量短小的毛刺狀突起，呈拉絲狀，有明顯的方向型；超聲輻照+微泡組細胞質中部細絲明顯減少，熒光暗淡，未構成明顯的網(wǎng)絡狀，周邊毛刺狀突起減少，見圖4。

圖3 四組細胞微管結構對比 ①：超聲輻照+微泡組；②：超聲輻照組；③微泡組；④空白對照組

圖4 四組細胞微絲結構對比 ①：超聲輻照+微泡組；②：超聲輻照組；③微泡組；④空白對照組

3 討論

侵襲和遷移是結腸癌威脅患者生命安全的主要原因，多數(shù)結腸癌患者在確診時已出現(xiàn)遠處轉移，即便早期結腸癌患者能夠及時接受手術治療，其中大部分仍死于遠處轉移[6-7]。抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移，對提升患者預后有一定價值[8-9]。

細胞骨架結構與細胞侵襲和遷移密切相關，細胞骨架主要由微管、微絲及中間纖維構成[10-11]。其中微絲主要由肌動蛋白構成，在細胞的變形運動中起關鍵作用[12]：微絲纖維生長，使細胞表面突出，形成片足，并在片組與基質接觸的位置形成粘著斑，隨后在肌動蛋白的作用下微絲纖維滑動，使細胞主體前移，同時解除細胞后方的粘著點，循環(huán)往復，使細胞向前移動；微管不僅對維持細胞形態(tài)、細胞分裂、信號傳導及物質輸送中有重要作用，且在腫瘤細胞分裂過程中存在微管動力學改變現(xiàn)象，同時微管動力學改變與染色體結構不穩(wěn)定有關[13]?？梢姡⒐芗拔⒔z形態(tài)與腫瘤侵襲及遷移能力密切相關。

本研究顯示空白對照組Lovo細胞中微管及微絲均存在聚集、重排現(xiàn)象，微絲向四周伸出大量短小的毛刺狀突起，有利于其運動與侵襲，與既往研究[14-15]結論一致。而本研究發(fā)現(xiàn)高機械指數(shù)超聲輻照微泡能夠降低微管和微絲表達輕度，使微管主要沿細胞長軸排列，并減少微絲的毛刺狀突起，這說明超聲輻照微泡能夠改變微管的組裝與分布，影響肌動蛋白應力纖維束的形成及粘著斑的合成與分布，從而改變Lovo細胞的侵襲和遷移能力，與鐘華等[16]觀察結果類似，楊名珍等[17]針對肺癌的研究也提示超聲輻照能夠改變腫瘤細胞的骨架。超聲輻照對腫瘤骨架的影響，主要得益于其空化效應[18-19]：微泡在超聲場的作用下，振動、生長并不斷聚集聲場能量，當能量超過某個閾值時，微泡急劇崩潰閉合，產(chǎn)生沖擊破，破壞細胞的正常結構。

本研究通過細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗直接觀察四組細胞的遷移及侵襲能力，顯示超聲輻照+微泡組細胞遷移及侵襲能力明顯下降，而單純應用超聲輻照或微泡，不會發(fā)生上述改變，與針對前列腺癌細胞PC-3的研究[20]結論相似，提示超聲輻照微泡形成的空化效應能夠抑制結腸癌轉移，其機制可能主要與超聲輻照微泡對腫瘤骨架的影響有關，這為結腸癌的靶向性治療提供了一定參考，即可能通過局部高機械指數(shù)超聲輻照微泡強化結腸癌的治療效果，但尚需臨床研究證實。

綜上，高機械指數(shù)超聲輻照微泡能夠抑制結腸癌Lovo細胞的侵襲及遷移能力，這可能與其能夠破壞Lovo細胞骨架結構有關。