細(xì)胞自噬在神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療中的研究進(jìn)展*

王京萍，曾令公，武世伍，馬 莉，柴大敏

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床病理科，蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233000)

1 自噬概述

“Autophagy”即自噬，這個詞是de Duve等[1]于1966年發(fā)現(xiàn)溶酶體的同時創(chuàng)造出來的，描述的是具有單層或雙層膜的結(jié)構(gòu)吞噬受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器等功能失調(diào)的細(xì)胞組分形成自噬體，之后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，最后將包裹物降解的一個過程。通過自噬降解的包裹物包括糖、核苷酸、氨基酸和脂肪酸，最終自噬體會同溶酶體進(jìn)行融合進(jìn)而將細(xì)胞器降解，這一過程可以為細(xì)胞提供大量的營養(yǎng)物質(zhì)以及用于細(xì)胞再生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。直到1992年Takeshige等[2]首次報道營養(yǎng)缺乏條件下誘導(dǎo)酵母細(xì)胞液中細(xì)胞成分的廣泛自噬降解，才鑒定出自噬機(jī)制中涉及的分子，并在隨后研究中闡明酵母細(xì)胞中自噬發(fā)生的分子機(jī)制并且將自噬相關(guān)基因統(tǒng)一命名為ATG(autophagy-related genes)。

1999年Liang 等[3]鑒定出的beclin-1(也稱為ATG6)是第1個被發(fā)現(xiàn)的具有介導(dǎo)自噬作用的哺乳動物基因，強(qiáng)制表達(dá)自噬基因不僅促進(jìn)營養(yǎng)剝奪誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞的自噬，而且抑制其腫瘤形成潛力，表明自噬可能是防止腫瘤細(xì)胞失調(diào)生長的基本機(jī)制；自噬作為應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制保護(hù)癌細(xì)胞免受低營養(yǎng)供應(yīng)或治療的損傷，還通過觸發(fā)非凋亡性細(xì)胞死亡程序參與癌細(xì)胞的消除，在腫瘤發(fā)展中具有負(fù)面作用；另一方面，越來越多的證據(jù)表明自噬在腫瘤的發(fā)展過程中起著促進(jìn)作用，當(dāng)腫瘤細(xì)胞在能量不足、缺氧和生長因子缺失等應(yīng)激條件下，自噬可以對細(xì)胞內(nèi)損傷的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器進(jìn)行吞噬降解，這一過程可以為腫瘤細(xì)胞提供能量[4]。從目前所知自噬與腫瘤之間存在著雙重的關(guān)系，如何使用好這把“雙刃劍”使其在腫瘤治療中將傷害降到最小化，我們還需更深入探討自噬的功能。

1.1自噬的分型和功能 自噬主要有3種類型：巨自噬、微自噬和伴侶介導(dǎo)自噬，其中巨自噬被認(rèn)為在細(xì)胞內(nèi)降解中起主要作用，目前所說自噬即巨自噬。自噬是細(xì)胞降解并回收細(xì)胞成分的穩(wěn)態(tài)過程，可以作為細(xì)胞存活和細(xì)胞死亡之間的平衡機(jī)制，自噬是通過在饑餓條件下使用細(xì)胞內(nèi)資源而在細(xì)胞存活中起作用的。這種動態(tài)過程包括隔離膜的形成，隔離膜的成核，延伸以及細(xì)胞成分的吞沒及雙膜的封閉4個步驟。調(diào)控自噬的分子機(jī)制是高度保守的，在酵母中它的調(diào)控機(jī)制也證實(shí)與哺乳動物細(xì)胞中保持高度一致[5]。

自噬過程是由一系列ATG嚴(yán)格調(diào)控，是一種動態(tài)細(xì)胞再循環(huán)系統(tǒng)，可降解細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物、異常蛋白質(zhì)聚集體以及過量或受損的細(xì)胞器，從而可以使用氨基酸等構(gòu)建模塊來創(chuàng)建新的細(xì)胞成分。當(dāng)待降解的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物被一小部分膜包圍時，就會發(fā)生自噬，從而形成自噬體。然后將自噬體與溶酶體融合，產(chǎn)生自噬溶酶體并通過溶酶體酶導(dǎo)致細(xì)胞組分降解。其中自噬的核心部分是自噬體，就是由膜運(yùn)輸介導(dǎo)的獨(dú)特的雙膜結(jié)構(gòu)，同時也是檢測自噬發(fā)生的金指標(biāo)之一。自噬通常通過營養(yǎng)缺乏的條件激活，但也與生理以及病理過程相關(guān)，例如發(fā)育、分化、神經(jīng)變性疾病、壓力、感染、肥胖和腫瘤；一方面自噬可以通過促進(jìn)蛋白質(zhì)分解代謝為腫瘤細(xì)胞及時提供能量而延長腫瘤細(xì)胞的壽命；而另一方面過度的自噬會引起自噬性程序性細(xì)胞死亡，即Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，從而起到抑制腫瘤生長的作用[6-7]。

1.2自噬的過程 自噬的分子機(jī)制主要在酵母中發(fā)現(xiàn)，并由許多ATG指導(dǎo)[8]。UNC-51樣蛋白激酶(UNC-51-like kinase 1, ULK-1)起到與酵母ATG1相似的作用，其作用于哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin，mTOR)復(fù)合物的下游[9]。ULK與ATG13和支架蛋白FIP200形成大的復(fù)合物。ATG通過ATG12-ATG5和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-B(microtubule-associated proteein 1 light chain 3-B，LC3-B)復(fù)合物控制自噬體形成。ATG12在泛素樣反應(yīng)中與ATG5綴合，這一過程需要ATG7和ATG10的參與；然后，ATG12-ATG5綴合物與ATG16非共價結(jié)合形成大的復(fù)合物。第2種復(fù)合物L(fēng)C3/ATG8在其C末端被ATG4蛋白酶切割以產(chǎn)生胞質(zhì)LC3-A。 LC3-A與泛素樣反應(yīng)中的磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)綴合，這一過程需要ATG7和ATG3的參與，即LC3-B以脂質(zhì)形式附著于自噬體膜。Sequestosome 1是一種由SQSTM1基因編碼的蛋白質(zhì)，也被稱為泛素結(jié)合蛋白p62(SQSTM1/p62)是一種結(jié)合LC3/ATG8的泛素結(jié)合蛋白，通過將含有SQSTM1/p62的蛋白質(zhì)聚集體帶到自噬體中來促進(jìn)自噬，從而完成降解[10]，見圖1。

Figure 1.The basic processes of autophagy and related pathways.

圖1 自噬的基本過程和有關(guān)通路

1.3自噬的調(diào)控 LC3存在于胞質(zhì)中，LC3-B始終穩(wěn)定地黏附在自噬體膜上，直到自噬體與溶酶體相融合，因此相對于LC3-A，LC3-B更穩(wěn)定，可以作為自噬體的標(biāo)志物。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylino-sitol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，即Akt)/mTOR信號通路在眾多細(xì)胞生物學(xué)過程中均起到至關(guān)重要的作用，包括細(xì)胞凋亡、自噬、代謝及血管新生。mTOR是自噬誘導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其中活化的mTOR[Akt和絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號傳導(dǎo)]抑制自噬，并且mTOR的負(fù)調(diào)節(jié)(AMPK和p53信號傳導(dǎo))促進(jìn)其自噬[11]。雷帕霉素(rapamycin)是mTOR的特異性抑制劑，沉默或抑制mTOR激酶的活性可以增強(qiáng)雷帕霉素的抗腫瘤作用[12]。

2 自噬與神經(jīng)膠質(zhì)瘤

2.1神經(jīng)膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)化治療 腫瘤是由于調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增生和存活通路的失調(diào)節(jié)引起的。神經(jīng)膠質(zhì)瘤是來源于神經(jīng)上皮的一種最常見的腫瘤，占所有原發(fā)性腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的24%。這些腫瘤在組織學(xué)上差異很大，從良性室管膜瘤到最具攻擊性和致命性的IV級多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)。毛細(xì)胞型神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后尚好，10年生存率可以達(dá)到90%；但是由于GBM生長呈侵襲性，極易復(fù)發(fā)、遷移，平均生存時間僅為15～18個月，患者5年生存率僅為5%[13]。目前較成熟的治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的化療方案有以下2種：(1)檢測O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)甲基化以預(yù)測替莫唑胺療效；(2)染色體1p/19q雜合性缺失(1p/19qLOH)，預(yù)測PCV(環(huán)己亞硝脲+長春新堿+甲基芐肼)方案(應(yīng)用最廣的療效最確切的腦膠質(zhì)瘤化療方案)預(yù)后好。

在美國和其它一些國家，使用貝伐單抗進(jìn)行抗血管生成治療被批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)性GBM[14]。最大安全性開顱手術(shù)、輔助放療和替莫唑胺用于新診斷的GBM，貝伐單抗用于復(fù)發(fā)性GBM。美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)的唯一針對膠質(zhì)瘤的靶向治療是貝伐單抗，其靶向血管內(nèi)皮生長因子，初步研究顯示貝伐單抗具有高放射學(xué)反應(yīng)率，可延長無進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)。雖然在整體人群中沒有觀察到貝伐單抗的生存獲益，但事后亞組分析確認(rèn)，為異檸檬酸脫氫酶1(isocitrate dehydrogenase 1, IDH1)野生型GBM亞組添加貝伐單抗后中位生存期可能增加4.3個月[15]。目前在國內(nèi)乃至國際上關(guān)于貝伐單抗的使用依然充滿爭議。

2.2自噬相關(guān)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的分子生物學(xué)研究 目前與自噬相關(guān)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的分子生物學(xué)研究有如下3種：(1)TP53突變，在星形細(xì)胞瘤起源的膠質(zhì)瘤中，TP53基因突變率達(dá)65%以上；(2)表皮生長因子受體Ⅷ(epidermal growth factor receptor，EGFRⅧ)，采用特異性EGFRⅧ單抗檢測高級別膠質(zhì)瘤，作為靶向治療的突破，EGFRⅧ第3階段實(shí)驗(yàn)失敗，疫苗正在研發(fā)；(3)IDH1，80%以上的低級別膠質(zhì)瘤存在IDH1基因第132位點(diǎn)雜合突變。膠質(zhì)瘤的放療、化療和光療均涉及自噬。詳細(xì)闡明細(xì)胞自噬機(jī)制，開發(fā)新的自噬誘導(dǎo)劑或抑制劑以及應(yīng)用策略促使膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，已經(jīng)成為膠質(zhì)瘤治療的新方向。

據(jù)報道，與低級星形細(xì)胞瘤和正常腦組織相比，GBM中beclin-1和LC3-B水平降低，這表明降低的自噬活性可能促使這些腫瘤進(jìn)展為更惡性的表型，GBM中beclin-1基因的缺失支持了自噬在該腫瘤發(fā)生中起抑制作用的理論[16]。

2.3自噬相關(guān)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的體外研究 有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，膠質(zhì)瘤和GBM細(xì)胞在暴露于電離輻射后表現(xiàn)出對細(xì)胞凋亡的強(qiáng)烈抵抗，凋亡相關(guān)基因如第10號染色體缺失性磷酸酶-張力蛋白同源蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)的表達(dá)狀態(tài)可能與該現(xiàn)象有關(guān)，并且干擾各種信號通路[17]。如上所述，PI3K/Akt/mTOR被認(rèn)為是調(diào)節(jié)自噬的主要途徑，通過使用Akt/mTOR抑制劑如雷帕霉素類似物抑制 Akt/mTOR活性，加劇了自噬過程[18]。雷帕霉素對氧糖剝奪損傷的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞具有保護(hù)作用，這一過程與激活自噬相關(guān)[19]。Akt抑制劑在放射抗性和放射敏感性U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo)自噬死亡，并增強(qiáng)對輻射的敏感性，但不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。還有各種研究著重于自噬抑制的神經(jīng)膠質(zhì)瘤放射敏感性：Yuan等[21]的研究表明，使用siRNA抑制ATG5或使用3-甲基腺嘌呤抑制自噬可增強(qiáng)STAT3抑制后神經(jīng)膠質(zhì)瘤的放射敏感作用。

2017年Jiang等[22]進(jìn)行體外和體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)鹽酸青藤堿(sinomenine hydrochloride，SH)通過活性氧物質(zhì)生成和自噬-溶酶體途徑激活而抑制人GBM細(xì)胞生長；在2種細(xì)胞系均發(fā)現(xiàn)SH參與活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生和自噬-溶酶體途徑激活，并通過Akt-mTOR和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase，JNK)通路來誘導(dǎo)自噬發(fā)生，從而抑制GBM細(xì)胞生長。2017年Duan等[23]在U87MG細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)沉默自噬特異性基因beclin-1有助于減弱神經(jīng)膠質(zhì)瘤中缺氧誘導(dǎo)的血管生成擬態(tài)。2018年Navone等[24]研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林可以影響腫瘤血管生成并使人GBM內(nèi)皮細(xì)胞對替莫唑胺、貝伐單抗和舒尼替尼敏感，從而損害VEGF相關(guān)信號傳導(dǎo)。2018年Zhao等[25]研究發(fā)現(xiàn)腺相關(guān)病毒2介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子陷阱的基因轉(zhuǎn)移可以作為膠質(zhì)瘤的一種新的治療選擇。這些發(fā)現(xiàn)也提供了一個用于治療人GBM的新型潛在治療劑。

2.4自噬相關(guān)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床研究 BriceZo 等[26]在2003年進(jìn)行了第一批臨床試驗(yàn)，他們將18例患有膠質(zhì)母細(xì)胞瘤且均接受手術(shù)、化療和放療的患者分成2組進(jìn)行臨床用藥治療，實(shí)驗(yàn)組每天服用150 mg的氯喹(一種自噬抑制劑)，同對照組相比實(shí)驗(yàn)組有明顯較長的中位生存期[實(shí)驗(yàn)組(33±5)個月，對照組(11±2)個月]，并在2006年繼續(xù)進(jìn)行臨床研究，在123名患有GBM的患者中讓其自由選擇接受氯喹作為任選的輔助治療，同時進(jìn)行常規(guī)手術(shù)、化療和放療，共有41名患者參與到實(shí)驗(yàn)組，氯喹在加入GBM的常規(guī)治療時發(fā)揮強(qiáng)烈的佐劑作用[氯喹治療組患者的生存時間為(25.0±3.4)個月，而對照組為(11.4±1.3)個月][27]。隨后，Golden等[28]和Lee等[29]再次印證了這一觀點(diǎn)并為其找出了理論依據(jù)，即替莫唑胺和氯喹聯(lián)合治療的協(xié)同作用依賴于自噬形成和膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的p53狀態(tài)。干擾性自噬可能確實(shí)在治療膠質(zhì)瘤和GBM方面有所作為。圖2所示為一種假設(shè)的方案，主要針對替莫唑胺聯(lián)合放射治療期間GBM致敏的自噬[30]。其中，功能性自噬死亡是指由于溶酶體潛能耗盡而導(dǎo)致的過度自噬活動之后的死亡；非功能性自噬死亡指的自噬體與溶酶體無法融合導(dǎo)致自噬體無法承受的累積之后的死亡；細(xì)胞凋亡即Ⅰ型程序性死亡，是由DNA或膜損傷引發(fā)從線粒體釋放半胱天冬酶導(dǎo)致的死亡。

Figure 2.Autophagy for glioblastoma sensitization during temozolomide and radiotherapy.

圖2 關(guān)于替莫唑胺聯(lián)合放射治療期間膠質(zhì)母細(xì)胞瘤致敏的自噬

目前在臨床實(shí)驗(yàn)研究官網(wǎng)上可以找到的臨床實(shí)驗(yàn)研究包含5項(xiàng)(autophagy and gliomas;http://clinicaltrials.gov)：(1)HIT-HGG研究組在兒童和青少年中用于治療高級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤、彌漫性腦橋腦膜瘤和腦膠質(zhì)瘤的國際合作型III期試驗(yàn)，分別設(shè)置替莫唑胺聯(lián)合氯喹和替莫唑胺聯(lián)合丙戊酸的試驗(yàn)，屬于第3階段試驗(yàn)(編號NCT03243461)；(2)在惡性膠質(zhì)瘤放化療中加入氯喹，在新診斷的GBM的同步化放療時加入氯喹，II期隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn)(編號NCT02432417)；(3)四氫大麻酚+大麻二酚(tetrahydrocannabinol +cannabidiol，THC+CBD/TN-TC11G)聯(lián)合替莫唑胺加放療用于治療新診斷的GBM，是內(nèi)部劑量遞增臨床試驗(yàn)，現(xiàn)處于I期，評估TN-TC11G(THC+CBD)聯(lián)合替莫唑胺和放射治療新診斷GBM患者的安全性(編號NCT03529448)；(4)DNX2401和替莫唑胺治療復(fù)發(fā)性GBM，DNX2401(以前命名的Delta-24-RGD或tasadenoturev，是一種腫瘤選擇性的，具有復(fù)制能力的溶瘤腺病毒)溶瘤腺病毒聯(lián)合替莫唑胺，治療第一次復(fù)發(fā)的GBM，I期試驗(yàn)(編號NCT01956734)；(5)加入氯喹用于新診斷的GBM的同步化放療，I期試驗(yàn)(編號NCT02378532)。

3 展望

一方面，抑制自噬已經(jīng)展現(xiàn)出一些前景研究結(jié)果，但神經(jīng)母細(xì)胞瘤中明顯的腫瘤抑制作用的自噬會提示誘導(dǎo)自噬將是一種更實(shí)際的治療方法，特別是在這些細(xì)胞凋亡有缺陷時。此外，如果說誘導(dǎo)自噬在促進(jìn)免疫系統(tǒng)中發(fā)揮實(shí)際作用的話，抑制自噬則有破壞免疫監(jiān)視的風(fēng)險。因此，我們想要更深入了解癌癥干細(xì)胞及其在癌癥進(jìn)展及復(fù)發(fā)中的作用，那么對于膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的自噬過程進(jìn)行全面分析是非常必要的，可能因此就可以把握改善患者預(yù)后的關(guān)鍵點(diǎn)。然而，必須解決的一個關(guān)鍵問題是放射療法和替莫唑胺是否會引發(fā)功能性自噬反應(yīng)，或者它們只是解除了自噬導(dǎo)致的不可降解的自噬體積聚。這需要在使用遞增劑量的放射療法或替莫唑胺后監(jiān)測細(xì)胞系中自噬流和溶酶體動力學(xué)的研究，因?yàn)閯┝糠桨缚赡苁嵌x自噬反應(yīng)類型的主要因素。

當(dāng)前新的放射治療技術(shù)允許每個部分向腫瘤遞送高劑量，同時減少對周圍正常腦組織的劑量。即使在放射抗性細(xì)胞系中，阻斷自噬通量的大分割是否可以與晚期自噬阻滯劑有效結(jié)合以利用非功能性自噬死亡是一個值得研究的問題。替莫唑胺是與放療聯(lián)合使用時發(fā)揮作用，還是只針對放療后復(fù)發(fā)的腫瘤，其機(jī)制是不是同放射治療引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬死亡一樣？在標(biāo)準(zhǔn)放療期間或放射治療失敗后，mTOR抑制劑(或增強(qiáng)劑)與低劑量替莫唑胺的組合，會引發(fā)功能性自噬死亡，也可能是一種有前景的方法。放療與替莫唑胺聯(lián)合對于自噬反應(yīng)的調(diào)節(jié)似乎是延長生存和更好地理解GBM治療之謎的最有希望的方法之一，但仍然缺少需要創(chuàng)建可靠概念的重要見解。

由于自噬與腫瘤之間存在著雙重的關(guān)系，我們應(yīng)選取自噬抑制劑還是促進(jìn)劑應(yīng)用到神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療中，怎樣消除自噬對腫瘤細(xì)胞的能量提供，怎樣誘發(fā)自噬性細(xì)胞死亡，都是亟待解決的關(guān)鍵問題。關(guān)于自噬在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的具體機(jī)制，還需要更透徹的研究。