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    淫羊藿苷減輕高糖誘導(dǎo)的C2C12肌管細(xì)胞胰島素抵抗*

    2019-05-28 09:06:00付學(xué)東何秉燕王捷榮鄧幼平
    中國(guó)病理生理雜志 2019年5期
    關(guān)鍵詞:肌管質(zhì)膜淫羊

    付學(xué)東,劉 巍,何秉燕,王捷榮,鄧幼平

    (武漢大學(xué)中南醫(yī)院兒科,湖北 武漢 430071)

    胰島素抵抗是糖尿病患者標(biāo)志性、特征性事件,在糖尿病(尤其是2型糖尿病)的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[1-2]。因此,探尋具有改善胰島素抵抗作用的生物活性分子,揭示其潛在的分子機(jī)制,將有助于加深對(duì)糖尿病發(fā)生、發(fā)展分子機(jī)制的認(rèn)識(shí),并有可能為糖尿病的治療提供新的作用靶點(diǎn)。淫羊藿苷(icariin,ICA)是從淫羊藿草中分離得到的異戊烯基黃酮醇苷,具有多種生物學(xué)效應(yīng)[3]。近年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道,淫羊藿苷具有調(diào)節(jié)胰島素敏感性和脂質(zhì)代謝的作用[4-5],因而有可能被用于糖尿病及其相關(guān)疾病的防治[6-7]。盡管如此,對(duì)淫羊藿苷抗胰島素抵抗的分子機(jī)制仍缺乏深入的了解。本研究利用高糖誘導(dǎo)C2C12肌管細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗,觀(guān)察淫羊藿苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的肌細(xì)胞胰島素抵抗的影響,并探討其可能的機(jī)制。

    材 料 和 方 法

    1 細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)條件

    C2C12小鼠成肌細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心(American Type Culture Collection,ATCC),在含10% 胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)和1% 青霉素/鏈霉素(penicillin/streptomycin,P/S)的DMEM培養(yǎng)液,于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng) 。經(jīng)分化培養(yǎng)液(含0.1% FBS、1% P/S和1 mmol/L 胰島素的DMEM)培養(yǎng)72 h,C2C12成肌細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為C2C12肌管細(xì)胞[8]。25 mmol/L 葡萄糖被用于誘導(dǎo)胰島素抵抗;5.5 mmol/L 葡萄糖作為對(duì)照,并加入19.5 mmol/L的甘露醇以避免滲透壓對(duì)細(xì)胞的可能影響。

    為探討淫羊藿苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗的影響,實(shí)驗(yàn)分為:正常糖對(duì)照(control,Con)組、正常糖+胰島素處理(control+insulin, Con+INS)組、高糖+胰島素處理(high glucose+insulin,HG+INS)組及高糖+淫羊藿苷+胰島素處理(high glucose+icariin+insulin, HG+ICA+INS)組。

    已有研究表明,淫羊藿苷改善正常C2C12肌管細(xì)胞胰島素信號(hào)的有效工作濃度為50~100 μmol/L[5]。因此,在本文的劑量研究中,淫羊藿苷的工作濃度分別為25 μmol/L、50 μmol/L及75 μmol/L,作用時(shí)間為24 h。在時(shí)間效應(yīng)的研究中,淫羊藿苷的工作濃度50 μmol/L,作用時(shí)間分別為12 h、24 h及36 h。根據(jù)時(shí)間和劑量效應(yīng)的研究結(jié)果,確定其后的機(jī)制研究中淫羊藿苷處理?xiàng)l件為:濃度50 μmol/L、作用時(shí)間24 h。為觀(guān)察胰島素信號(hào)的變化,細(xì)胞在無(wú)血清處理的條件下,經(jīng)100 nmol/L的胰島素處理10 min。

    在p38 MAPK抑制劑實(shí)驗(yàn)中,無(wú)血清處理的C2C12肌管細(xì)胞接受10 μmol/L的p38 MAPK特異性抑制劑SB203580處理1 h,再經(jīng)50 μmol/L的淫羊藿苷處理24 h,隨后接受100 nmol/L的胰島素處理10 min。

    2 主要試劑

    DMEM液體培養(yǎng)液、FBS和P/S等購(gòu)自Gibco;淫羊藿苷、p38 MAPK抑制劑SB203580和DMSO購(gòu)自Sigma-Aldrich;p38 MAPK 小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA) 、對(duì)照 siRNA和各種抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology;Glucose Uptake Assay Kit(Colorimetric)購(gòu)自Abcam。

    3 主要方法

    3.1細(xì)胞質(zhì)膜的分離 按文獻(xiàn)方法,離心分離細(xì)胞質(zhì)膜[9]。方法簡(jiǎn)述如下:細(xì)胞在含10 mmol/L Tris-HCl(pH=7.8)、10 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L苯基甲基磺酰氟、0.5 mmol/L二硫蘇糖醇、5 mg/L抑肽酶、10 mg/L亮抑酶肽及0.1% Noni-det P-40的緩沖液裂解,4 ℃、1 000×g離心2次,每次10 min;得到的沉淀重懸于含有1% Nonidet P-40的緩沖液中,并在4 ℃、10 000×g離心20 min,得到質(zhì)膜部分。Western blot法觀(guān)察葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)的表達(dá),膜特異性蛋白cadherin 檢測(cè)質(zhì)膜分析的有效性。

    3.2siRNA轉(zhuǎn)染 使用Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,siRNA使用濃度為120 pmol/L,具體操作嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,Western blot法評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。

    3.3葡萄糖攝取 細(xì)胞葡萄糖攝取量測(cè)定采用Glucose Uptake Assay Kit (Colorimetric),按說(shuō)明書(shū)操作。

    3.4Western blot實(shí)驗(yàn) 用于檢測(cè)蛋白或磷酸化蛋白的表達(dá),方法簡(jiǎn)述如下:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,除去培養(yǎng)液,冰冷的PBS洗滌細(xì)胞,細(xì)胞經(jīng)裂解緩沖液[含20 mmol/L HEPES(pH=7.9)、 350 mmol/L NaCl、500 mmol/L KCl、0.5 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L EGTA、1 mmol/L MgCl2、10% 甘油、1% Nonidet P-40、10 mmol/L NaF、0.1 mmol/L NaV、8 mmol/L β-甘油磷酸酯、磷酸酶抑制劑混合物I和II (Sigma-Aldrich)]裂解;其后,10 000×g、4 ℃離心10 min,分離保留上清,BCA(bicinchonininc acid)法測(cè)定蛋白濃度,并調(diào)整蛋白濃度為2 g/L;加入等量的2×SDS 上樣緩沖液,100 ℃加熱10 min,10 000×g、4 ℃離心10 min,取上清用于SDS-PAGE 分離蛋白,轉(zhuǎn)移蛋白到硝化纖維素膜,并用特異性抗體檢測(cè)蛋白或磷酸化蛋白的表達(dá)。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    使用XLSTAT Premium 2018軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)4次,并具有類(lèi)似的結(jié)果。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。單因素方差分析(one-way ANOVA)對(duì)組間差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 淫羊藿苷減輕高糖誘導(dǎo)的C2C12肌管細(xì)胞胰島素抵抗

    與正常糖對(duì)照組比較,高糖降低了Akt T308的磷酸化水平,而淫羊藿苷可阻止高糖誘導(dǎo)的Akt T308磷酸化水平降低。具體表現(xiàn)為,以25、50和75 μmol/L的淫羊藿苷處理細(xì)胞24 h,可見(jiàn)淫羊藿苷以劑量依賴(lài)方式提高Akt T308磷酸化(P<0.05或P<0.01);而以50 μmol/L的淫羊藿苷處理細(xì)胞12、24和36 h,可見(jiàn)淫羊藿苷以時(shí)間依賴(lài)方式提高Akt T308磷酸化 (P<0.05或P<0.01),見(jiàn)圖1。此外,與正常糖對(duì)照組比較,高糖顯著降低了胰島素刺激所致的GLUT4質(zhì)膜轉(zhuǎn)位和細(xì)胞對(duì)2-脫氧葡萄糖(2-deoxyglucose, 2-DG)的攝取(P<0.01),而淫羊藿苷可抑制高糖對(duì)GLUT4質(zhì)膜轉(zhuǎn)位和細(xì)胞對(duì)2-DG攝取的影響(P<0.01),見(jiàn)圖2。

    Figure 1. The impacts of icariin (ICA) on insulin (INS)-stimulated Akt T308 phosphorylation in C2C12 myotubes treated with high glucose (HG). A: the dose-dependent response; B: the time-dependent response. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol (Con) group;#P<0.05,##P<0.01vsHG+INS group.

    圖1 淫羊藿苷對(duì)高糖處理的C2C12肌管細(xì)胞Akt T308磷酸化的影響

    Figure 2. The impacts of icariin (ICA) on insulin (INS)-stimulated GLUT4 translocation on plasma membrane (A) and 2-deoxyglucose (2-DG) uptake (B) in C2C12 myotubes treated with high glucose (HG). Mean±SD.n=4.**P<0.01vsCon+INS group;##P<0.01vsHG+INS group.

    圖2 淫羊藿苷對(duì)高糖處理的C2C12肌管細(xì)胞GLUT4質(zhì)膜轉(zhuǎn)位和2-DG攝取的影響

    2 淫羊藿苷提高p38 MAPK磷酸化

    與正常糖對(duì)照組比較,高糖顯著降低了胰島素刺激所致的p38 MAPK磷酸化(P<0.01);而淫羊藿苷可抑制高糖對(duì)p38 MAPK磷酸化的影響(P<0.01)。此外,我們還觀(guān)察到,p38 MAPK磷酸化和Akt T308磷酸化的變化方向相一致,見(jiàn)圖3。

    Figure 3.The impacts of icariin (ICA) on insulin (INS)-stimulated p38 MAPK phosphorylation in C2C12 myotubes treated with high glucose (HG). Mean±SD.n=4.**P<0.01vsCon+INS group;##P<0.01vsHG+INS group.

    圖3 淫羊藿苷對(duì)高糖處理的C2C12肌管細(xì)胞p38 MAPK磷酸化的影響

    3 抑制p38 MAPK降低淫羊藿苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗的抑制作用

    p38 MAPK特異性抑制劑SB203580消除了淫羊藿苷對(duì)p38 MAPK和Akt T308磷酸化、GLUT4質(zhì)膜轉(zhuǎn)位及細(xì)胞2-DG攝取的影響(P<0.01),見(jiàn)圖4。 此外,我們還觀(guān)察到,p38MAPKsiRNA可有效降低p38 MAPK的蛋白表達(dá),并顯著抑制淫羊藿苷對(duì)高糖作用下Akt T308磷酸化、GLUT4質(zhì)膜轉(zhuǎn)位及細(xì)胞對(duì)2-DG攝取的影響(P<0.05或P<0.01),見(jiàn)圖5。

    Figure 4.The inhibitor of p38 MAPK, SB203580 (SB), abolished the inhibitory effects of icariin (ICA) on high glucose (HG)-induced insulin (INS) resistance in C2C12 myotubes. A: Akt T308 and p38 MAPK phosphorylation; B: GLUT4 translocation on plasma membrane; C: 2-DG uptake. Mean±SD.n=4.**P<0.01vsHG+INS group;##P<0.01vsHG+ICA+INS group.

    圖4 p38 MAPK抑制劑降低淫羊藿苷對(duì)高糖誘導(dǎo)C2C12肌管細(xì)胞胰島素抵抗的抑制作用

    Figure 5.Thep38MAPKknockdown abolished the inhibitory effects of icariin (ICA) on high glucose (HG)-induced insulin (INS) resistance in C2C12 myotubes. A: Akt T308 phosphorylation; B: GLUT4 translocation on plasma membrane; C: 2-DG uptake. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsHG+INS group;#P<0.05,##P<0.01 HG+ICA+INS group.

    圖5 敲減p38MAPK降低淫羊藿苷對(duì)高糖誘導(dǎo)C2C12肌管細(xì)胞胰島素抵抗的抑制作用

    討 論

    Akt是胰島素信號(hào)通路中的重要信號(hào)分子,其磷酸化和活性直接受到胰島素刺激的調(diào)節(jié),同時(shí)也參與了對(duì)胰島素功能的調(diào)控。研究表明,Akt可在Thr308 (T308)和 Ser473(S473)2個(gè)位點(diǎn)發(fā)生磷酸化;其中,T308位點(diǎn)的磷酸化直接受控于胰島素激活的PDK1[5]。因此,Akt T308磷酸化的變化可直接反映胰島素信號(hào)系統(tǒng)的功能狀態(tài)。在本研究中,高糖顯著降低了胰島素刺激的Akt T308磷酸化,而淫羊藿苷可以在高糖作用下以劑量和時(shí)間依賴(lài)方式提高C2C12肌管細(xì)胞Akt T308的磷酸化,并伴有GLUT4質(zhì)膜轉(zhuǎn)移和細(xì)胞對(duì)2-DG攝取的提高,表明淫羊藿苷具有改善高糖誘導(dǎo)的C2C12肌管細(xì)胞胰島素抵抗的作用。

    早期研究表明,淫羊藿苷可增加正常培養(yǎng)的C2C12肌管細(xì)胞的脂聯(lián)素(adiponectin)產(chǎn)量,促進(jìn)AMPK、IRS-1及PI3K的磷酸化,因而被認(rèn)為可能會(huì)影響胰島素信號(hào)的敏感性[10]。盡管AMPK在調(diào)節(jié)脂聯(lián)素生產(chǎn)和胰島素信號(hào)通路中具有重要作用,本研究未觀(guān)察到高糖對(duì)C2C12肌管細(xì)胞AMPK磷酸化的影響,也未觀(guān)察到淫羊藿苷對(duì)高糖作用下C2C12肌管細(xì)胞AMPK磷酸化的影響(資料未顯示)。有研究表明,與無(wú)葡萄糖對(duì)照組比較,葡萄糖具有降低AMPKα(Thr172)磷酸化水平的作用[11]。因此,AMPK在高糖誘導(dǎo)的C2C12肌管細(xì)胞胰島素抵抗中的作用有待進(jìn)一步研究。同時(shí),本研究也證實(shí)淫羊藿苷減輕高糖誘導(dǎo)的C2C12肌管細(xì)胞胰島素抵抗的作用不依賴(lài)于AMPK。

    p38 MAPK可控制骨骼肌細(xì)胞胰島素信號(hào)傳導(dǎo)、葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂肪酸代謝和能量消耗等,在骨骼肌代謝功能的調(diào)節(jié)中具有重要作用[12-13]。提高正常培養(yǎng)或胰島素抵抗下C2C12肌管細(xì)胞的p38 MAPK磷酸化或活性可改善細(xì)胞胰島素信號(hào),增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取[14-15]。與上述結(jié)果相一致,本研究結(jié)果表明,高糖可降低p38 MAPK磷酸化,且p38 MAPK磷酸化的降低與Akt T308磷酸化的降低、GLUT4質(zhì)膜轉(zhuǎn)位的降低及細(xì)胞對(duì)2-DG攝取的降低相一致,提示p38 MAPK是高糖誘導(dǎo)C2C12肌管細(xì)胞胰島素抵抗的關(guān)鍵因素。在本研究中,淫羊藿苷可恢復(fù)高糖作用下C2C12肌管細(xì)胞p38 MAPK磷酸化,抑制p38 MAPK活性和降低p38 MAPK蛋白表達(dá)均可顯著降低淫羊藿苷對(duì)Akt T308 磷酸化、GLUT4質(zhì)膜轉(zhuǎn)位及細(xì)胞對(duì)2-DG攝取的影響,提示淫羊藿苷通過(guò)提高p38 MAPK的磷酸化或活性而減輕高糖誘導(dǎo)的C2C12肌管細(xì)胞的胰島素抵抗。

    總之,本研究的結(jié)果表明淫羊藿苷具有減輕C2C12細(xì)胞胰島素抵抗的作用,這為了解淫羊藿苷抗糖尿病的作用機(jī)制提供了參考資料。但對(duì)于淫羊藿苷是如何控制p38 MAPK磷酸化或活性的具體機(jī)制尚待深入研究。

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