鼻炎癥狀兔的細(xì)菌感染情況調(diào)查與分析

趙巧雅，吳 靜，姜亦飛，孫海濤，譚善杰，黃 兵

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，濟(jì)南 250023；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，濟(jì)南 250100；3.臨沂市畜牧獸醫(yī)局，山東 臨沂 276001）

家兔鼻炎是規(guī)?；B(yǎng)兔場和個體養(yǎng)殖戶經(jīng)常發(fā)生的臨床癥狀，其病因極為復(fù)雜，直接影響家兔出欄率，給養(yǎng)兔戶造成一定的經(jīng)濟(jì)損失［1］。傳統(tǒng)微生物鑒定方法主要是通過革蘭氏染色鏡檢、生化反應(yīng)以及利用伯杰氏手冊等材料進(jìn)行對比分析，存在精度低、不利于大批量菌群分析鑒定等缺點(diǎn)［2-3］。而16S rRNA存在于所有細(xì)菌染色體中，利用16S rRNA測序技術(shù)對樣品中的細(xì)菌進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，具有高通量、可實(shí)現(xiàn)不可培養(yǎng)細(xì)菌的準(zhǔn)確鑒定等一系列優(yōu)勢［4］。本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)方法結(jié)合測序?qū)Ρ茄装Y狀兔的帶菌情況進(jìn)行了分析，為兔場防治及合理治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從山東某規(guī)模化兔場出現(xiàn)鼻炎癥狀兔中隨機(jī)采集鼻腔棉拭子25份，12 h內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

pMD-18T克隆載體購自TAKARA公司；PCR擴(kuò)增試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購自Axygen公司，酵母粉、胰蛋白胨、瓊脂粉等細(xì)菌培養(yǎng)基及其他試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)

將樣品在SC肉湯（亞硒酸鹽-半胱氨酸肉湯）中，37℃、18～24 h預(yù)增菌進(jìn)行選擇性培養(yǎng)后，用接種環(huán)以劃線形式接種到5%胎牛血清培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。在培養(yǎng)基上分別挑取典型或可疑菌落，革蘭氏染色鏡檢。

1.4 16S rRNA基因測序

取單個細(xì)菌菌落懸浮于50 μL生理鹽水作為模板，使用16S通用引物27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和 1492R（TACGGYTACCTTGTTACGACTT）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系：模板 1μL，上下游引物（20 pmol/μL）各0.5 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，補(bǔ)充去離子水至 25 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 40 s、53℃復(fù)性 40 s、72℃延伸 1 min，35個循環(huán)，最后 72℃預(yù)變性10 min。將PCR產(chǎn)物克隆到pMD-18T載體上，送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序分析。

1.5 藥敏試驗(yàn)

無菌條件下將純培養(yǎng)的細(xì)菌按照WHO推薦的瓊脂紙片擴(kuò)散法（K-B）［5］，分別挑取分離的純培養(yǎng)菌的單菌落用無菌生理鹽水稀釋，吸取200 μL菌液均勻涂布于普通瓊脂平板，用無菌小鑷子夾取各類藥敏片，平貼于平板表面，37℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈大小，藥敏結(jié)果按NCCLS標(biāo)準(zhǔn)作出判定。

2 結(jié)果

2.1 分離菌培養(yǎng)特征及形態(tài)觀察

各分離菌株經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)、顯微鏡觀察后初步分離出151個菌株，分別編號為A1、A2…A151，部分菌落形態(tài)及細(xì)菌形態(tài)如圖1所示。

圖1部分檢出菌鏡檢圖

2.2 16S rRNA基因測序結(jié)果

對所有分離菌進(jìn)行16S PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠瓊脂電泳驗(yàn)證，均成功擴(kuò)增。將測序結(jié)果輸入GenBank進(jìn)行同源性檢索，所有分離株與對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性均在94%～100%之間?；驕y序結(jié)果顯示，大部分菌株為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和奇異變形桿菌，此外還檢測出鮑曼不動桿菌、波氏桿菌、枯草芽孢桿菌、多殺性巴氏桿菌以及綠膿桿菌等，各類菌數(shù)量及所占百分比如表1。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對8種鑒定菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。所有檢出菌對紅霉素、磺胺異噁唑的耐藥率最高，其次為阿奇霉素和慶大霉素。所有分離菌均對阿米卡星不耐藥。枯草芽孢桿菌對15種抗生素敏感性均較高。

表1各分離菌數(shù)量及百分比

表2鑒定菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

近年來，隨著兔規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，兔鼻炎的發(fā)病率呈上升趨勢，直接影響兔群的出欄率，且病因極為復(fù)雜［6］。本試驗(yàn)從山東省某兔場25只鼻炎癥狀兔的鼻腔棉拭子中分離得到了151株細(xì)菌，經(jīng)16S rRNA基因測序及序列比對，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、奇異變形桿菌等8種細(xì)菌為主要菌群。根據(jù)臨床癥狀、各分離菌的種類及所占比例，該場鼻炎兔的病原菌疑為多殺性巴氏桿菌、波氏桿菌及金黃色葡萄球菌混合感染。

本研究的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，所有檢出菌對紅霉素、磺胺異噁唑的耐藥率最高，所有分離菌均對阿米卡星不耐藥，可對該場及該地區(qū)鼻炎兔的用藥治療提供參考及指導(dǎo)作用。本研究與朱芝秀等［7］、曾彥欽等［8］報道中的同類細(xì)菌的藥敏結(jié)果存在較大差異，這是由于臨床用藥的差異，以及各養(yǎng)殖場、各地區(qū)對細(xì)菌的種類和耐藥譜差異很大。因此，建議規(guī)范管理兔場及合理使用抗生素，定期對分離菌株進(jìn)行抗生素敏感性檢測，對有效防止兔場疾病發(fā)生有重要意義。