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      肺炎支原體感染對(duì)支氣管哮喘病兒外周血1、9、17型輔助性T細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子水平的影響

      2019-05-24 00:55:50程秀芳陳俊松
      安徽醫(yī)藥 2019年6期
      關(guān)鍵詞:病兒哮喘病滴度

      程秀芳,陳俊松

      支氣管哮喘為一種涉及多種炎性細(xì)胞(如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等)及介質(zhì)的慢性氣道炎癥性疾病,氣道重塑及氣道高反應(yīng)性為其基本病理特點(diǎn)[1-3]。由于小兒支氣管病理過(guò)程復(fù)雜,尚無(wú)明確發(fā)病機(jī)制,在輔助性T細(xì)胞1型(Th1)/輔助性T細(xì)胞2型(Th2)細(xì)胞之間的平衡失調(diào)導(dǎo)致Th2細(xì)胞占據(jù)主要地位被認(rèn)為是最經(jīng)典的哮喘病理機(jī)制理論,研究證實(shí)Th1、輔助性T細(xì)胞9型(Th9)、輔助性T細(xì)胞17型(Th17)及相關(guān)細(xì)胞因子在兒童支氣管哮喘病理過(guò)程中扮演重要角色[4-5]。肺炎支原體(MP)感染被認(rèn)為是誘發(fā)哮喘的重要因素,有學(xué)者推測(cè)MP可特異性誘導(dǎo)免疫球蛋白IgE產(chǎn)生并與肥大細(xì)胞及嗜堿性細(xì)胞受體結(jié)合,使致敏的肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒,釋放組胺、慢反應(yīng)物質(zhì)等炎性介質(zhì),而誘發(fā)或加重哮喘,因此MP感染與哮喘發(fā)作關(guān)系密切[6]。本研究主要分析MP感染對(duì)支氣管哮喘兒童外周血Th1、Th9、Th17及相關(guān)細(xì)胞因子水平的影響,現(xiàn)報(bào)告如下。

      1 資料與方法

      1.1 一般資料選取2015年1月至2018年1月安陽(yáng)市人民醫(yī)院收治的78例伴MP感染支氣管哮喘病兒、86例單純支氣管哮喘病兒、50例健康兒童為研究對(duì)象,分別納入MP陽(yáng)性組、MP陰性組、對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)支氣管哮喘病兒符合《中國(guó)支氣管哮喘防治指南(基層版)——支氣管哮喘的診斷與鑒別診斷》[7]中支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn),有喘息、氣促、胸悶、咳嗽表現(xiàn);(2)MP陽(yáng)性病兒入院1周測(cè)定的肺炎支原體抗體(MP-IgM)效價(jià)較入院時(shí)倍數(shù)升高;(3)本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求,病兒近親屬知情同意并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)其他呼吸道疾病、結(jié)核或其他合并細(xì)菌與病毒感染者;(2)心、肝、腎嚴(yán)重功能障礙者;(3)嚴(yán)重血液系統(tǒng)疾病或其他病原體感染兒童;(4)其他原因引起的喘息、氣促、胸悶、咳嗽或近期有呼吸道感染病史者。MP陽(yáng)性組中男44例,女34例;年齡范圍為3~9歲,年齡(6.13±0.78)歲;支氣管哮喘病程范圍為23~29個(gè)月,病程(26.11±2.72)個(gè)月。MP陰性組中男49例,女37例;年齡范圍為3~10歲,年齡(6.15±0.75)歲;支氣管哮喘病程范圍為24~29個(gè)月,病程(26.25±2.22)個(gè)月,兩組性別、年齡、支氣管哮喘病程比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.005,P=0.942;t=0.167,P=0.867;t=0.362,P=0.718)。對(duì)照組中男26例,女24例;年齡范圍為3~9歲,年齡(6.14±0.76)歲,與MP陽(yáng)性組、MP陰性組性別、年齡相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(與MP陽(yáng)性組比較:χ2=0.239,P=0.625;t=0.072,P=0.943;與MP陰性組比較:χ2=0.317,P=0.574;t=0.075,P=0.941)。

      1.2 方法

      1.2.1MP檢測(cè)方法 取受檢者靜脈血2 mL,在3 000 r/min下離心10 min,分離血清后保存于-80 ℃下待測(cè),采用日本富士Serodia-Myco Ⅱ MP抗體診斷試劑盒,以被動(dòng)凝集實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清MP特異性抗體(MP-IgM),嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。MP陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn):滴度>1∶80,同時(shí)分為1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560等不同滴度,本研究選擇1∶80、1∶320、1∶1 280三個(gè)滴度進(jìn)行分析。

      1.2.2Th1、Th9、Th17及相關(guān)細(xì)胞因子水平測(cè)定 采集受檢者空腹靜脈血6 mL,其中3 mL于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中,分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs),洗滌2次后重懸于RPMI-1640培養(yǎng)液,進(jìn)行胞外染色、細(xì)胞培養(yǎng)、固定破膜、胞內(nèi)染色,以美國(guó)Beckman Cloulter公司提供的CytomicsTMFC500型流式細(xì)胞儀檢測(cè)各淋巴細(xì)胞膜及細(xì)胞因子熒光強(qiáng)度,界定CD4+IL-1+為T(mén)h1細(xì)胞,CD4+IL-9+為T(mén)h9細(xì)胞,CD4+IL-17+為T(mén)h17細(xì)胞。另取3 mL靜脈血,3 000 r/min離心10 min,分離血清,保存于-80 ℃,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定γ-干擾素(IFN-γ)、白介素-18(IL-18)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。IFN-γ試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司,IL-18、TNF-α試劑盒分別由上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司、北京晶美生物制劑公司提供。檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

      1.3 觀(guān)察指標(biāo)(1)比較三組病兒入院時(shí)外周血Th1、Th9、Th17及IFN-γ、IL-18、TNF-α水平;(2)分析MP陽(yáng)性組中,不同MP-IgM滴度病兒外周血Th1、Th9、Th17及IFN-γ、IL-18、TNF-α水平;(3)比較MP陽(yáng)性組中急性發(fā)作期、緩解期病兒外周血Th1、Th9、Th17及IFN-γ、IL-18、TNF-α水平;(4)分析MP-IgM滴度與各指標(biāo)相關(guān)性。

      2 結(jié)果

      2.1 三組Th1、Th9、Th17及相關(guān)細(xì)胞因子比較MP陽(yáng)性組外周血Th1低于MP陰性組、對(duì)照組(t=6.396,P=0.000;t=15.492,P=0.000),MP陽(yáng)性組Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α水平高于MP陰性組、對(duì)照組(與MP陰性組比較,tTh9=21.494,PTh9=0.000;tTh17=18.593,PTh17=0.000;tIFN-γ=6.399,PIFN-γ=0.000;tIL-18=9.361,PIL-18=0.000;tTNF-α=26.593,PTNF-α=0.000;與對(duì)照組比較,tTh9=43.186,PTh9=0.000,tTh17=35.184,PTh17=0.000,tIFN-γ=34.634,PIFN-γ=0.000,tIL-18=7.891,PIL-18=0.000,tTNF-α=34.979,PTNF-α=0.000),MP陰性組、對(duì)照組上述指標(biāo)比較也差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tTh1=10.826,PTh1=0.000;tTh9=30.168,PTh9=0.000;tTh17=18.917,PTh17=0.000;tIFN-γ=30.975,PIFN-γ=0.000;tIL-18=14.071,PIL-18=0.000;tTNF-α=16.871,PTNF-α=0.000),見(jiàn)表1。

      2.2 不同MP-IgM滴度病兒Th1、Th9、Th17及相關(guān)細(xì)胞因子比較MP陽(yáng)性病兒中,MP-IgM滴度分別為1∶80 10例、1∶160 13例、1∶320 14例、1∶640 19例、1∶1 280 10例、1∶2 560 12例,本研究選擇1∶80、1∶320、1∶1 280滴度進(jìn)行分析。隨MP-IgM滴度增加,Th1呈下降趨勢(shì),而Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α上升,尤其是Th9、Th17、TNF-α在不同滴度病人中比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

      2.3 不同哮喘發(fā)作期病兒Th1、Th9、Th17及相關(guān)細(xì)胞因子比較MP陽(yáng)性病兒中,急性發(fā)作期40例、緩解期38例,急性發(fā)作期Th1低于緩解期,急性發(fā)作期Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α高于緩解期(P<0.05),見(jiàn)表3。

      2.4 MP-IgM滴度與各指標(biāo)相關(guān)性分析相關(guān)性分析顯示,支氣管哮喘伴MP感染病兒MP-IgM滴度與外周血Th1呈負(fù)相關(guān),與Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α呈正相關(guān)(P<0.05),見(jiàn)表4。

      表4 MP-IgM滴度與各指標(biāo)相關(guān)性分析

      3 討論

      支氣管哮喘是兒童常見(jiàn)變態(tài)反應(yīng)性疾病,我國(guó)第三次城市兒童哮喘流行病學(xué)資料調(diào)查顯示,兒童哮喘的患病率、累計(jì)患病率與前次調(diào)查相比,分別增加50.6%、52.8%[8-9]。T細(xì)胞尤其是Th1及Th9細(xì)胞、Th17細(xì)胞在誘導(dǎo)哮喘發(fā)作、氣道炎癥方面已被證實(shí)具有重要作用,復(fù)雜的免疫反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致Th1細(xì)胞表達(dá)缺失,而導(dǎo)致Th9細(xì)胞、Th17細(xì)胞表達(dá)增加,有研究發(fā)現(xiàn)輕中度過(guò)敏性哮喘病人急性發(fā)作期Th9細(xì)胞、Th17細(xì)胞的特異性基因表達(dá)與特異性細(xì)胞因子生成增加[10-11]。長(zhǎng)期臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)MP感染是誘發(fā)兒童支氣管哮喘的重要因素,MP誘發(fā)哮喘的機(jī)制包括MP黏附纖毛上皮細(xì)胞,引起纖毛功能損傷及上皮細(xì)胞破壞,可作為特異性抗原,引起氣道變態(tài)反應(yīng),加重哮喘兒童氣道炎癥反應(yīng),同時(shí)這也涉及病兒易感體質(zhì)個(gè)體特征[12-13]。但目前關(guān)于MP感染對(duì)支氣管哮喘病兒Th1、Th9、Th17及相關(guān)細(xì)胞因子的影響較少報(bào)道。

      表1 三組Th1、Th9、Th17及相關(guān)細(xì)胞因子比較

      注:三組各指標(biāo)整體比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。與對(duì)照組比較,aP<0.05;與MP陰性組比較,bP<0.05

      表2 不同MP-IgM滴度病兒Th1、Th9、Th17及相關(guān)細(xì)胞因子比較

      注:MP-IgM 1∶80、1∶320、1∶1 280各滴度Th1、Th9、Th17及相關(guān)細(xì)胞因子比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。與1∶80滴度比較,aP<0.05;與1∶320滴度比較,bP<0.05

      表3 伴MP陽(yáng)性不同哮喘發(fā)作期病兒Th1、Th9、Th17及相關(guān)細(xì)胞因子比較

      Th1細(xì)胞為CD4陽(yáng)性細(xì)胞,主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等致炎因子,在活化巨噬細(xì)胞、組織細(xì)胞內(nèi)微生物感染、抗腫瘤反應(yīng)等方面有重要作用。其中TNF-α是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子,能增加中性粒細(xì)胞與嗜酸性粒細(xì)胞功能,刺激其產(chǎn)生超氧化物,釋放溶酶體酶,對(duì)周?chē)?xì)胞產(chǎn)生毒性作用,IL-18也與哮喘急性發(fā)作密切相關(guān),IFN-γ是Th1型細(xì)胞因子,對(duì)Th2型淋巴細(xì)胞形態(tài)及功能有抑制作用[14-15]。本次研究結(jié)果顯示MP陽(yáng)性組外周血Th1低于MP陰性組、對(duì)照組;MP陽(yáng)性組Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α水平高于MP陰性組、對(duì)照組;MP陰性組、對(duì)照組上述指標(biāo)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明MP感染不僅會(huì)加重惡性肺部病變,也會(huì)影響支氣管哮喘病兒Th1、Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α水平,通過(guò)IFN-γ、IL-18、TNF-α等細(xì)胞因子,上調(diào)輔助性T淋巴細(xì)胞Th9、Th17細(xì)胞免疫反應(yīng),下調(diào)Th1,而使T淋巴細(xì)胞失衡,加重哮喘[16],這與康玉亭等[17]通過(guò)研究得出的支原體肺炎病兒Th1、Th2型細(xì)胞因子(IL-18、TNF-α)水平升高可能在支原體肺炎伴喘息病兒中發(fā)揮重要作用的結(jié)論相似。本研究也顯示,MP陽(yáng)性病兒中,隨MP-IgM滴度增加,Th1呈下降趨勢(shì),而Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α上升,尤其是Th9、Th17、TNF-α在不同滴度病人中比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,同時(shí)與哮喘緩解期病兒相比,哮喘急性發(fā)作期病兒Th1下降,Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α水平升高,這與文獻(xiàn)[18]的報(bào)道結(jié)果基本一致,Th1細(xì)胞主要通過(guò)分泌Th1型細(xì)胞因子,增加巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗感染與抗細(xì)胞內(nèi)病原體感染的免疫反應(yīng),主要分泌IFN-γ、TNF-α,Th9可分泌高水平IgE,產(chǎn)生氣道嗜酸性粒細(xì)胞性炎癥,促進(jìn)氣道黏液分泌與嗜酸性粒細(xì)胞聚集,增加氣道高反應(yīng)性[19],而Th17具有相對(duì)獨(dú)立的增殖、分化、調(diào)節(jié)機(jī)制,可特異性產(chǎn)生IL-17等細(xì)胞因子,激活哮喘病人成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞,產(chǎn)生并分泌一系列與氣道重構(gòu)有關(guān)的細(xì)胞因子如TNF-α等,參與介導(dǎo)哮喘的發(fā)病與調(diào)節(jié)[20],因而本次研究可觀(guān)察到隨MP-IgM滴度增加,哮喘急性發(fā)作,支氣管哮喘病兒Th1下降,而Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α呈上升趨勢(shì)。此外本研究相關(guān)性分析也顯示,支氣管哮喘伴MP感染病兒MP-IgM滴度與外周血Th1呈負(fù)相關(guān),與Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α呈正相關(guān),進(jìn)一步證實(shí)了MP感染與支氣管哮喘病兒Th1、Th9、Th17及相關(guān)細(xì)胞因子的關(guān)系。

      綜上所述,MP感染可下調(diào)支氣管哮喘病兒Th1,上調(diào)其Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α水平,而加重氣道高反應(yīng)性,尤其在哮喘急性發(fā)作期上述因子變化更明顯,臨床應(yīng)加以監(jiān)測(cè)。

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