微小RNA-144在活動期肺結(jié)核病人外周血中的表達水平及臨床意義

周冰，徐巖松，侯麗麗，謝耀萍，付鵬

肺結(jié)核又稱為癆病，是由結(jié)核分枝桿菌感染導致的慢性炎性疾病，全球病人數(shù)量每年以數(shù)百萬的速度增加，由于結(jié)核桿菌感染而導致死亡的人數(shù)在感染性疾病中居第二位[1-2]。同時有些病人感染結(jié)核桿菌后并不會立即發(fā)病，當機體的免疫力下降或變態(tài)反應增強時，才表現(xiàn)出肺結(jié)核癥狀，全世界范圍內(nèi)有1/3的人的結(jié)核分枝桿菌處于潛伏感染期[2-3]。中國有近50%的人感染結(jié)核桿菌，結(jié)核桿菌已成為肺結(jié)核新發(fā)病例的主要病原菌，因此對肺結(jié)核病人進行早期的診斷和治療具有重要意義[4]。目前臨床上診斷方法主要包括細菌學檢測、細胞因子檢測、抗原檢測等，但是這些方法具有耗時長，可能出現(xiàn)假陰性，對樣品要求高等缺點，會干擾肺結(jié)核的及時診斷和治療[1，5]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(micro RNA，miRNA)在結(jié)核病病人外周血中穩(wěn)定存在，其表達水平會升高或者降低，參與肺部疾病的發(fā)生及發(fā)展，能夠調(diào)控基因表達，作為新的生物標志物成為研究熱點[6]，隨著對miRNA的研究不斷深入，有研究[4]證實微小RNA-144(mir-144)的表達水平與宿主的免疫功能聯(lián)系密切，但其臨床意義并未深入研究。本研究通過檢測活動期肺結(jié)核病人外周血中mir-144的表達水平及臨床意義，旨在為臨床診斷活動期肺結(jié)核提供新的方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2016年1月至2017年4月哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學科收治的活動期肺結(jié)核病人98例，所有病人胸部X線掃描發(fā)現(xiàn)病灶，并經(jīng)細菌學診斷均呈陽性。納入標準：①年齡>18歲；②臨床資料完整，且依從性高；③經(jīng)病人及其近親屬同意，并簽署知情同意書。排除標準：①合并心、肝、腎臟器病變；②患有糖尿病、甲狀腺功能亢進、類風濕關(guān)節(jié)炎等全身免疫性疾病；③入組前曾使用影響免疫功能的藥物；④中途退出的病人。活動期肺結(jié)核組中男69例，女29例；年齡(50.23±6.02)歲，年齡范圍為26～75歲；體質(zhì)量指數(shù)(22.08±1.25)kg/m2，體質(zhì)量指數(shù)范圍為19.87～24.62 kg/m2；病程為(3.02±1.17)個月，病程范圍為1～6個月。另外選擇同期進行體檢的健康志愿者62例作為對照組，其中男40例，女22例；年齡為(50.09±5.65)歲，年齡范圍為25～73歲；體質(zhì)量指數(shù)為(21.97±1.13)kg/m2，體質(zhì)量指數(shù)范圍為19.43～24.67 kg/m2。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，研究過程均符合相關(guān)規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1樣品收集及RNA提取 受試者均空腹抽取外肘靜脈血2 mL，置于涂有肝素鈉的采血管中，30 min內(nèi)將200 μL全血裝入含有Trizol 和研磨珠的凍存管中，充分振蕩均勻后，置于-80 ℃冰箱中備用待測。參照Trizol Reagent試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書提取血液中總RNA，使用適量核糖核酸酶(Ribonuclease,RNase)水充分溶解RNA，應用核酸測定儀檢測濃度和純度，RNA的完整性檢測使用瓊脂糖凝膠電泳分析，調(diào)整其濃度后，置于 -80 ℃冰箱中保存。

1.2.2熒光定量PCR 應用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國QIAGEN有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，取20 μL待測樣品，包括1 μL總RNA，分別取5份反轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL、1份反轉(zhuǎn)錄酶1 μL和4份RNase水14 μL，在37 ℃下反應1 h，然后在95 ℃下反應5 min。mir-144引物序列為5′-ATCCAGTGCGTGTCGTCGTG-3′(由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成)，具體的條件：在95 ℃下預變性5 min；變形和延伸的溫度為95 ℃，時間為5 s；60 ℃反應20 s；72 ℃反應20 s，共計40個循環(huán)；78 ℃下反應20 s進行熒光收集。內(nèi)參為管家基因U6，采用相對定量法計算外周血中mir-144的相對表達水平。

1.2.3血漿中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-10(IL-10)及單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)表達水平檢測 受試者均空腹抽取外肘靜脈血3 mL，置涂有肝素鈉的采血管中，以3 500 r/min的速度離心10 min，離心半徑為3 cm，分離上清液，即得血漿。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血漿中TNF-α、IL-10及MCP-1水平，試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，嚴格按照說明書進行操作。

1.3 觀察指標比較血液中mir-144和血漿中TNF-α、IL-10及MCP-1表達水平，另外分析活動期肺結(jié)核病人血液中mir-144的表達水平和血漿中TNF-α、IL-10及MCP-1表達水平的相關(guān)性。根據(jù)研究數(shù)據(jù)繪制血漿mir-144診斷活動性肺結(jié)核的受試者工作特征曲線(ROC)，計算曲線下面積，用最大約登指數(shù)法確定血漿mir-144診斷活性期肺結(jié)核的的截斷值，計算用此截斷值診斷活動性肺結(jié)核的靈敏度和特異度。

2 結(jié)果

2.1 血液中mir-144和血漿中TNF-α、IL-10及MCP-1表達水平的比較活動期肺結(jié)核病人血液中mir-144的表達水平明顯低于對照組，而血漿中TNF-α、IL-10及MCP-1表達水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組mir-144、TNF-α、IL-10及MCP-1表達水平的比較

2.2 血液中mir-144和血漿中TNF-α、IL-10及MCP-1表達水平的相關(guān)性活動期肺結(jié)核病人血液中mir-144的表達水平與血漿中TNF-α、IL-10及MCP-1表達水平呈負相關(guān)(r=-0.718、-0.709、-0.723，P=0.019、0.022、0.018)。數(shù)據(jù)散點圖見圖1。

圖1 血液中mir-144和血漿中TNF-α、IL-10及MCP-1表達水平的相關(guān)散點圖

2.3 mir-144的診斷意義根據(jù)本研究數(shù)據(jù)繪制血漿mir-144診斷活動性肺結(jié)核的ROC曲線(圖2)，曲線下面積為0.944，用最大約登指數(shù)法確定血漿mir-144診斷活性期肺結(jié)核的截斷值為1.47，用其診斷活動性肺結(jié)核的靈敏度和特異度分別為96.88%(155/160)和96.77%(60/62)。

圖2 血漿中mir-144診斷活動性肺結(jié)核的ROC曲線

3 討論

結(jié)核分枝桿菌作為細胞內(nèi)致病菌，其宿主一旦被感染，激活信號傳導通路，抑制機體的免疫應答反應，結(jié)核分枝桿菌與Toll樣受體作用，通過激活多種信號通路而發(fā)揮抗炎及抑菌效應[7]。結(jié)核分枝桿菌通過激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路而上調(diào)TNF-α、IL-10及MCP-1的合成量，前炎性因子激活巨噬細胞，加強其吞噬作用，殺死病菌，提高抗結(jié)核的活性，結(jié)核的免疫類型主要為巨噬細胞參與的細胞免疫過程，結(jié)合感染的過程中巨噬細胞產(chǎn)生特異性miRNA，并且在肺結(jié)核病人血液中檢測到miRNA[8-9]。miRNAs由21～25個核苷酸組成，主要在哺乳動物的細胞內(nèi)表達，轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達，雖然在人類基因總數(shù)中占比不足5%，但是卻可以調(diào)控超過30%的基因。

miRNAs參與胚胎發(fā)育、細胞增殖分化和細胞凋亡和死亡等過程，同時miRNA對免疫細胞分化、信號傳導及免疫應答等免疫反應的多層面能夠進行精細調(diào)節(jié)[6，10]。血液中miRNAs能夠作為多種疾病如胃癌等的生物學早期診斷指標，目前對于 mir-144的研究主要集中在血液系統(tǒng)疾病上，對于炎性疾病，尤其是結(jié)核病的研究并不多見[6，11]。另外潛伏期肺結(jié)核的細菌實驗呈陽性，但是影像學檢查結(jié)果與正常人差異無統(tǒng)計學意義，有超過85%的活動期肺結(jié)核病人是由潛伏期肺結(jié)核演變來的，因此準確判斷潛伏期的肺結(jié)核對于預防和控制活動期肺結(jié)核具有重要意義[5]。

在哺乳動物體內(nèi)的非編碼RNA主要包括短小RNA、miRNA及小分子RNA等[12-13]，miRNA在臨床樣本中的穩(wěn)定性高，并且可以快速準確定量，有望成為非創(chuàng)傷性生物學指標來反映疾病的發(fā)生及發(fā)展過程，miRNA目前已經(jīng)被廣泛應用于心臟病、糖尿病及感染性疾病中[3，13-14]。miRNA來源于內(nèi)源性染色體，由長度為70～80核苷酸的單鏈RNA組成的短序列，其存在形式分為單拷貝、多拷貝或基因簇，并且多存在于基因間隔區(qū)，獨立性較強，不能翻譯成蛋白質(zhì)，主要是通過降解對應mRNA影響蛋白質(zhì)的表達水平，調(diào)控機體的代謝過程[5]。結(jié)核分枝桿菌通過影響miRNA的表達水平影響細胞因子和免疫應答反應，檢測結(jié)核病人血清中1 223種miRNA的表達水平，其中59種miRNA表達水平升高，而33種miRNA表達水平降低，提示miRNA對于評價結(jié)核病的診斷及治療效果具有重要作用[3]。

研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，活動期肺結(jié)核病人血液中mir-144的表達水平明顯低于對照組(P<0.05)，說明mir-144能夠用于反映肺結(jié)核的發(fā)生和發(fā)展，另外血漿mir-144診斷活動性肺結(jié)核的ROC曲線下面積為0.944，截斷值為1.47，同時診斷活動性肺結(jié)核的靈敏度和特異度分別為96.88%和96.77%，提示使用mir-144診斷活動期肺結(jié)核意義重大。機體感染結(jié)核桿菌后，機體產(chǎn)生相應的免疫反應，導致細胞因子等物質(zhì)的釋放，主要包括TNF-α、IL-10及MCP-1，對于結(jié)核病的發(fā)生及發(fā)展具有重要作用，TNF-α、IL-10及MCP-1是體內(nèi)促炎因子，影響活動性肺結(jié)核，從而清除結(jié)核分枝桿菌的病原體[7，16]。結(jié)果表明活動期肺結(jié)核病人血漿中TNF-α、IL-10及MCP-1表達水平明顯高于對照組病人，說明結(jié)核桿菌激活機體的免疫防御機制，上調(diào)細胞因子的釋放量。相關(guān)性研究結(jié)果表明血液中mir-144的表達水平與血漿中TNF-α、IL-10及MCP-1表達水平呈負相關(guān)(P<0.05)。mir-144主要在T淋巴細胞中表達，調(diào)節(jié)細胞免疫過程[10]，有研究證實[17]，mir-144在活動性肺結(jié)核病人的外周血單個核細胞的表達水平高于健康志愿者，可能是通過抑制淋巴T細胞增殖調(diào)節(jié)抗結(jié)核免疫反應。另外miRNA主要影響MAPK和NF-κB等信號通路，結(jié)核桿菌可能通過miRNA調(diào)控的信號通路，抑制機體的免疫應答，感染性疾病的機體內(nèi)的病毒通過基因沉默機制“逃脫”免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，依賴miRNA抵抗機體的免疫反應[5，7]。

綜上所述，活動期肺結(jié)核病人外周血中mir-144的表達水平異常降低，并且與TNF-α、IL-10及MCP-1呈負相關(guān)，臨床診斷價值高，為今后研究活動期肺結(jié)核的預防和診斷提供新的思路和方法。