PCBP1對6-OHDA作用的SH-SY5Y細胞凋亡影響的研究

賈冰冰 霍麗蓉

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)主要發(fā)生在中老年時期，是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，病理上主要表現(xiàn)為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的缺失死亡，紋狀體內(nèi)多巴胺含量減少，路易小體形成。許多研究認為，基因和環(huán)境的改變均可導(dǎo)致PD的發(fā)生，但神經(jīng)元細胞死亡的具體機制目前尚不清楚[1]。有研究顯示，將6-OHDA注射入紋狀體內(nèi)，黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元細胞可出現(xiàn)凋亡和壞死等形態(tài)學(xué)改變，因此6-OHDA是與PD發(fā)病有關(guān)一種神經(jīng)毒素[2]。多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白1[poly(rC)-binding protein 1,PCBP1]，是細胞內(nèi)的一種橋梁蛋白質(zhì)，PCBP1于哺乳動物的各組織中廣泛分布，PCBP1可參與mRNAs-蛋白復(fù)合體的形成及其他多種生物學(xué)過程[3]。為了進一步探討毒素作用下的神經(jīng)元細胞周期是否受到PCBP1的調(diào)控作用，應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將PCBP1全長cDNA的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞系，研究在神經(jīng)毒素6-OHDA作用下,PCBP1對SH-SY5Y細胞周期變化的影響。

材料與方法

1.材料及試劑：SH-SY5Y細胞由北京兒童醫(yī)院兒科研究所惠贈；含PCBP1序列的重組質(zhì)粒(本室構(gòu)建保存)；胎牛血清、1%青/鏈霉素、1640培養(yǎng)液、小提質(zhì)粒試劑盒、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、TagDNA聚合酶、LipHigh脂質(zhì)體高效轉(zhuǎn)染試劑均為上海生物工程有限公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根生化科技有限公司)；PCR Master Mix(北京索萊寶生物科技有限公司)；AnnexinV/PI雙染凋亡試劑盒(四正柏生物公司)；6-OHDA(美國Sigma公司)；流式細胞儀(美國BD Calib公司),倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

2.重組pEGFP/N1-PCBP1質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定：采用PCR擴增PCBP1目的序列，引物含有EcoRⅠ酶切位點，pcbp1的PCR擴增引物：TTCTAGAATTCATGGATGCCGGTGTGACTGAAAGTG和TTCTAGAATTCA-ACCTACACTGTTCTAGCTGCACC；應(yīng)用PCR反應(yīng)混合物：模板<1μg，上下游引物(10μmol/L)各2μl，2×Master Mix 25μl，加水補足至50μl。PCR反應(yīng)循環(huán)設(shè)置：94℃，4min；再設(shè)30個循環(huán):94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min；最后72℃，5min。之后將PCR產(chǎn)物純化、EcoR酶I切后與質(zhì)粒pEGFP-N1連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dh5α。通過克隆篩選，擴增，經(jīng)測序證明PCBP1正確重組到pEGFP/N1質(zhì)粒上。

3.SH-SY5Y細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞以1×106個/ml接種于60mm細胞培養(yǎng)皿中，于含1%青霉素和鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細胞生長至密度接近70%～80%時，將細胞培養(yǎng)液更換為不含抗生素的培養(yǎng)基。取4μg pEGFP/N1-PCBP1(實驗組)或pEGFP/N1質(zhì)粒(對照組)滴加至250μl的1640培養(yǎng)基，同時將10μl的脂質(zhì)體滴加250μl的1640培養(yǎng)基，緩慢混勻，室溫靜置5min后，將兩種質(zhì)?；旌衔锓謩e加入脂質(zhì)體混合物中，緩慢混勻后室溫靜置20min，形成兩種轉(zhuǎn)染工作液。將上述轉(zhuǎn)染工作液逐滴加入細胞培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8h后，更換為含抗生素的完全培養(yǎng)基。于瞬時轉(zhuǎn)染24h時，在倒置熒光顯微鏡觀察細胞綠色熒光蛋白表達。

4.6-OHDA作用于兩組細胞：將SH-SY5Y細胞以1×105/ml密度接種到12孔板內(nèi)，每孔1ml；細胞生長至密度70%～80%時，細胞饑餓處理后分別將pEGFP/N1-PCBP1質(zhì)粒(實驗組)和pEGFP-N1質(zhì)粒(對照組)按照前述方法轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞。轉(zhuǎn)染24h時，分別將終濃度為5、15、25μmol/L的6-OHDA滴加到實驗組和對照組SH-SY5Y細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)24h；另將終濃度為25μmol/L的6-OHDA滴加到實驗組和對照組細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)4、8、24h后進行流式檢測。

5.細胞周期檢測：將不同處理組的細胞收集到離心管內(nèi)，5min，1000×g離心；棄上清，向離心管中加入1ml PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，棄上清；用1×結(jié)合緩沖液重懸細胞，取100μl的細胞懸液于5ml流式管中，加入5μl Annexin V/PE混勻后于室溫避光孵育5min；加入7AAD 10μl，并加入500μl PBS,進行流式檢測。

結(jié) 果

1.重組質(zhì)粒pEGFP/N1-PCBP1鑒定：根據(jù)載體質(zhì)粒特征性限制性酶切位點的位置，用EcoR I進行酶切后，理論上應(yīng)產(chǎn)生4700和1070bp兩個片段。經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1顯示，重組質(zhì)粒大小、酶切片段大小和理論值一致，經(jīng)測序鑒定PCBP1 cDNA序列插入正確。

圖1 EcoR Ⅰ酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析M.Maker；1.重組質(zhì)粒pEGFP/N1-PCBP1 EcoRⅠ酶切產(chǎn)物電泳；2.空載質(zhì)粒pEGFP-N1 EcoRⅠ酶切產(chǎn)物電泳

2.6-OHDA對轉(zhuǎn)染PCBP1重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒的細胞凋亡的影響：將不同濃度6-OHDA 作用于兩組SH-SY5Y細胞不同時間后，流式細胞儀分析結(jié)果顯示，5、15、25μmol/L 6-OHDA對實驗組和對照組細胞作用24h后，轉(zhuǎn)染PCBP1重組質(zhì)粒的細胞早期凋亡率低于轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表1，圖2，P<0.05)；轉(zhuǎn)染PCBP1重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的細胞晚期凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。25μmol/L 6-OHDA分別對實驗組和對照組細胞作用8、16、24h后(表2，圖3)， 轉(zhuǎn)染PCBP1重組質(zhì)粒的細胞早期凋亡率低于對照組細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；轉(zhuǎn)染PCBP1重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒的細胞晚期凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 不同濃度6-OHDA分別對實驗組和對照組作用24h后細胞凋亡率比較

對照組為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP/N1的SH-SY5Y細胞；實驗組為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP/N1-PCBP1的SH-SY5Y細胞。實驗組與對照組比較，P<0.05

討 論

近年來，細胞凋亡分子機制相關(guān)研究表明，多巴胺神經(jīng)元細胞的凋亡以及變性壞死是PD的一個重要發(fā)病機制，那么如何抗凋亡必然成為緩解PD發(fā)病的重要關(guān)注點。PCBP1屬于核不均一核糖核蛋白亞家族的一個成員，可在各種分子水平上參與基因表達的調(diào)控：如DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，mRNA向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)入與轉(zhuǎn)出，mRNA翻譯和穩(wěn)定性的調(diào)控，并且可參與蛋白與核酸及蛋白與蛋白之間的相互作用[4，5]。已有研究表明，PCBP1參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展，病毒基因表達，鐵轉(zhuǎn)運等方面的調(diào)控作用。目前，PCBP1在神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生、發(fā)展中的調(diào)控作用逐漸受到關(guān)注。有研究表明PCBP1與神經(jīng)纖維的發(fā)育有密切關(guān)系，隨著軸突的發(fā)育成熟，軸突細胞骨架成熟及軸突口徑增加可能與NF-M mRNA穩(wěn)定性提高有關(guān)，而該穩(wěn)定性增加源于PCBP1的KH同源域識別NF-M 3′-UTR的CU富含位點，進而促進NF-M mRNA水平增加、軸突成熟[6]。

圖2 不同濃度6-OHDA對實驗組和對照組細胞作用24h后細胞凋亡率的流式分析A～C為對照組細胞;A.5μmol/L 6-OHDA;B.15μmol/L 6-OHDA;C.25μmol/L 6-OHDA；D～F為實驗組細胞;D.5μmol/L 6-OHDA;E.15μmol/L 6-OHDA;F.25μmol/L 6-OHDA；其中右上象限為晚期凋亡細胞，右下象限為早期凋亡細胞

表2 25μmol/L 6-OHDA作用不同時間后的兩組細胞凋亡率比較

對照組為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP/N1的SH-SY5Y細胞；實驗組為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP/N1-PCBP1的SH-SY5Y細胞。實驗組與對照組比較，P<0.05

圖3 25μmol/L 6-OHDA對兩組細胞作用不同時間后細胞凋亡率的流式分析A～C為對照組細胞;A.6-OHDA作用8h;B.6-OHDA作用16h;C.6-OHDA作用24h；D～F為實驗組細胞;D.6-OHDA作用8h;E.6-OHDA作用16h;F.6-OHDA作用24h；其中右上象限為晚期凋亡細胞，右下象限為早期凋亡細胞

PCBP1可參與細胞增殖、凋亡及周期變化等生物學(xué)事件。本課題研究者通過動態(tài)貝葉斯網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，PCBP1可調(diào)控7個轉(zhuǎn)錄因子的活性和表達。其中，一部分轉(zhuǎn)錄子可參與細胞周期及凋亡的調(diào)節(jié)，如TP53、FOS、FST[7]。另外，將PCBP1轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細胞系SH-SY5Y細胞后，與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的細胞比較，細胞一定程度上加速生長，提示PCBP1對神經(jīng)細胞的生長發(fā)育有一定的調(diào)節(jié)作用[8]。Nishimura等[9]研究發(fā)現(xiàn)PCBP1與ORF57相互作用可提高脊髓灰質(zhì)炎病毒內(nèi)核糖體進入位點(internal ribosome-entry site,IRES)的轉(zhuǎn)錄，以及X相關(guān)的凋亡抑制子(X-linked inhibitor of apoptosis,XIAP)活性。在脊髓灰質(zhì)炎病毒中，ORF57表達增加時，XIAP活性可伴隨提高。因此，PCBP1可通過與ORF57相互作用，而參與病毒基因的調(diào)節(jié)。那么，6-OHDA是一種神經(jīng)毒素,可致細胞凋亡/死亡,是構(gòu)建帕金森病細胞/動物模型常用的一種毒素，PCBP1對6-OHDA作用的神經(jīng)細胞凋亡是否有影響，具體影響到什么階段是本項研究的關(guān)注點。研究經(jīng)流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)，不同濃度的6-OHDA對SH-SY5Y細胞作用24h后，實驗組與對照組比較，細胞早期凋亡率明顯較低(P<0.05)。同等劑量的6-OHDA對SH-SY5Y細胞作用不同時間后，實驗組較對照組細胞的早期凋亡率明顯較低(P<0.05)，提示在細胞早期凋亡階段，PCBP1可以起到一定程度的抗凋亡作用。

然而，本研究中不同濃度的6-OHDA作用相同時間以及同等劑量6-OHDA作用不同時間均顯示實驗組和對照組的細胞晚期凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示神經(jīng)病變細胞進入晚期凋亡后，PCBP1的參與仍然無法抗衡細胞凋亡的結(jié)局，研究神經(jīng)元變性細胞早期凋亡階段，PCBP1提高細胞抗凋亡能力的調(diào)控機制和調(diào)控作用，將對于PD等神經(jīng)變性病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后具有一定的意義。