經(jīng)鼻胰島素對腦出血小鼠TLR4信號表達的影響

范楊，楊進，朱媛，余巨明，蔣國會

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 南充 637000)

腦出血是一種嚴重的卒中亞型，具有高發(fā)病率、高致死率、高致殘率及高復(fù)發(fā)率的特點。而且，隨著人口老齡化、溶栓和抗凝劑的更多應(yīng)用，腦出血的發(fā)病率逐漸增加[1]。迄今為止，腦出血仍無有效的治療方法[2]。大量的研究證實，腦出血后除了顱內(nèi)血腫導(dǎo)致組織機械壓迫外，炎癥和氧化應(yīng)激途徑促發(fā)血腫周圍組織繼發(fā)性腦損傷[3]。Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)先天免疫中起著重要作用，TLR4信號參與腦出血后神經(jīng)炎癥過程[4-5]。TLR4主要在CD11b陽性小膠質(zhì)細胞中表達，經(jīng)核因子NF-κB信號在腦出血后早期促進炎癥細胞因子釋放，TLR4敲除或阻斷可減輕腦出血后繼發(fā)性腦損傷病理，并改善神經(jīng)功能缺損[6-7]。

當前觀點認為，神經(jīng)炎癥是大腦各種損傷和神經(jīng)退行性疾病病情進展的關(guān)鍵因素，在不同神經(jīng)疾病中腦TLRs是誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥起始和進展的中心環(huán)節(jié)。TLRs活化是不同器官包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗的關(guān)鍵分子[8]。數(shù)十年來，大腦被認為是免疫不敏感器官，但目前的研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)不僅有自己固有的免疫反應(yīng)機制，而且在適當?shù)臈l件下，外周炎癥細胞和因子可以穿過血腦屏障來進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[9]。TLRs是一組在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達的糖蛋白，識別相關(guān)的分子模式(PAMPs)和內(nèi)源性危險信號(破壞相關(guān)性分子模式或DAMPs)[10]。TLRs的胞內(nèi)信號有兩種途徑：大多數(shù)TLRs經(jīng)MyD88依賴信號通路(除TLR3外)，而TLR3和TLR4經(jīng)非MyD88依賴信號通路，TLR4是唯一可依賴于這兩條途徑的TLRs，所以TLR4信號在神經(jīng)炎癥中起著至關(guān)重要的作用[11]。腦出血后，紅細胞溶解產(chǎn)物導(dǎo)致小膠質(zhì)細胞TLR4激活而促進炎癥細胞因子釋放，加重腦水腫與神經(jīng)功能缺損。然而，應(yīng)用 TLR4 特異性抑制劑阻斷TLR4激活誘發(fā)的炎癥效應(yīng)，使腦出血后炎癥反應(yīng)得到明顯調(diào)控，說明腦出血后TLR4激活是繼發(fā)性腦損傷重要機制，TLR4是腦出血治療的關(guān)鍵靶標。

既往的觀念認為，大腦是胰島素不敏感的器官，胰島素一直作為外周組織的降糖激素而在臨床中廣泛應(yīng)用。30年前，研究者在腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)了胰島素和胰島素受體(insulin receptors，IR)，且有研究證據(jù)表明，腦內(nèi)胰島素通過胰島素受體及其下游信號在腦卒中、腦外傷、神經(jīng)變性疾病、心境及精神障礙等神經(jīng)精神疾病的發(fā)生、發(fā)展和康復(fù)過程中也有至關(guān)重要的作用[12-13]。而大腦胰島素信號是否參與腦出血病理生理過程仍然不得而知。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗動物采用10～12 周齡的SPF級雄性C57BL/6J 小鼠25只，購于川北醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，體重在22～24 g。實驗過程中小鼠飼養(yǎng)于無菌環(huán)境，潔凈水喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持在21 ℃左右，相對濕度維持在50%左右，日光燈提供12 h 晝/夜周期節(jié)律。小鼠數(shù)表法隨機分為假手術(shù)組(n=5)、ICH組(腦出血組)和ICH+Ins組(胰島素干預(yù)組)，腦出血和胰島素干預(yù)組小鼠又分為12 h、和72 h組(每組n=5)。假手術(shù)組僅于麻醉后，相應(yīng)部位插入微量注射針，僅有針道穿刺損傷，沒有注射自體血，不考慮顱內(nèi)血腫導(dǎo)致繼發(fā)性腦組織損傷，依據(jù)動物實驗管理規(guī)定，盡量減少實驗動物痛苦和數(shù)量，所以僅取12 h組作為對照。胰島素干預(yù)組于術(shù)前30 min ，給予0.5 U(5 μL)門冬胰島素(諾和諾德，中國天津)，采用頭后仰位，伸頸，用10 μL移液槍緩慢交替滴入雙側(cè)鼻腔。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠自體血腦出血模型構(gòu)建 術(shù)前將小鼠稱重后用4%水合氯醛360 mg/kg，稀釋后按0.1 mL/10 g體重的劑量進行動物麻醉。頭部固定后將注射針定位于前囟0.8 mm，旁開2 mm，深3.5 mm 位置；取小鼠新鮮自體尾動脈血20 μL，用微量注射泵，按2 μL/min速率勻速注射入小鼠腦紋狀體，靜止10 min后緩慢拔針，采用骨蠟封閉顱骨創(chuàng)口后縫合頭皮[14]。術(shù)后于相應(yīng)時間點取大鼠血腫周圍部分腦組織，-80 ℃冰箱保存。采用Western blot和RT-PCR技術(shù)檢測血腫周圍組織TLR4、NF-κB和TNF-α蛋白和mRNA表達水平的變化。

1.2.2 提取RNA及RT-PCR 血腫周圍組織總RNA提取，按照試劑盒常規(guī)說明進行Trizol(Gibco，USA)。所有樣本均進行DNAse處理后完成逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成，按照(iScriptcDNA synthesis kit，Bio-Rad，USA)試劑盒常規(guī)說明完成。樣本數(shù)據(jù)分析使用Nanodrop ND-100分析儀(Thermo Fisher Scientific Inc，USA)，樣品A260/A280比值為1.8～2.0。采用1 μg模板進行擴增，擴增試劑盒使用PCR-miX(天根，北京)。引物由上海生工合成，序列如下：TLR4上游引物為5’-AATCTGGTGGCTGTGGAG-3’，TLR4下游引物為5’-CCCTGAAAGGCTTGGTCT-3’；NF-κB上游引物為5’-TTCCAAGACTACGACAGCCACA-3’，下游引物為5’-GCCGCTTCCTCATATCCTCAAT-3’；對照為GAPDH上游引物為5’-TCACTGCCACCCAGAAGA-3’，GAPDH下游引物為5’-CCTGTTGCTGTAGCCGTAT-3’。PCR循環(huán)條件為：94 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性2 min，然后60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s。45個循環(huán)后于72 ℃延伸45 s。反應(yīng)產(chǎn)物TLR4為287 bp，NF-κB為346 bp和GAPDH 為428 bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳。對TLR4 和NF-κB的灰度值與GAPDH灰度值的比值進行分析。

1.2.3 Western blot表達檢測 從-80 ℃冰箱中取出組織樣本，在液氮中研磨。之后用RIPA強蛋白裂解液按照說明書步驟進行蛋白提取(碧云天生物公司，江蘇)。依次進行蛋白質(zhì)量濃度測量和蛋白變性等處理。使用SDS-PAGE相關(guān)試劑制備10%凝膠，隨后進行電泳和轉(zhuǎn)膜，并封閉4 h后加入兔多克隆抗體TLR4(1∶2 000，Abcam)，4 ℃過夜。次日加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗(按1∶10 000稀釋，用0.01 mol/L PBS稀釋)，室溫下平穩(wěn)搖動2 h。洗膜后使用ECL顯色、拍照和分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，以單因素方差分析(one-wayANOVA)對結(jié)果進行分析處理。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因檢測結(jié)果

采用RT-PCR方法檢測TLR4和NF-KB的基因表達變化。TLR4條帶位置于287 bp，NF-κB條帶位置在346 bp，GAPDH位置在428 bp位置。統(tǒng)計結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，各組TLR4和NF-κBmRNA表達水平均顯著增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與腦出血組12 h組相比，胰島素治療12 h組的兩者表達明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與腦出血72 h組相比，鼻內(nèi)胰島素治療72 h組的TLR4和NF-κBmRNA表達明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 蛋白檢測結(jié)果

前述實驗檢測結(jié)果說明，胰島素治療能夠影響TLR4和NF-KB的基因表達。進一步通過Western Blot檢測TLR4和NF-KB蛋白變化，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，各組差異均有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與腦出血組12 h組相比，胰島素治療12 h組的兩者表達明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與腦出血72 h組相比，鼻內(nèi)胰島素治療72 h組的TLR4和NF-κBmRNA表達明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

3 討論

大腦受各種損傷和理化因素刺激均可導(dǎo)致氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和胰島素信號受損，研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)炎癥與中樞胰島素破壞密切相關(guān)。高脂飲食(HFD)或肥胖可誘導(dǎo)中樞胰島素抵抗，并導(dǎo)致的神經(jīng)元活動和遷移能力降低。TLR4基因敲除或中和炎癥介質(zhì)可預(yù)防這一過程，表明TLR4可能參與了中樞胰島素抵抗的誘導(dǎo)過程。在糖尿病的研究中發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗、破壞PI3K/Akt的GSK3信號、解除TLR4激活的負反饋調(diào)節(jié)環(huán)路，均可加重TLR4活化導(dǎo)致的組織損傷[15-16]。

經(jīng)鼻腦靶向胰島素可快速、高效的提高腦內(nèi)胰島素濃度，且不經(jīng)過血腦屏障(BBB)，避免了肝臟首過消除效應(yīng)，除鼻粘膜輕微刺激外，幾乎無毒副作用[17]。采取頭后仰位，經(jīng)鼻前庭滴注胰島素后數(shù)分鐘到達腦內(nèi)，10～30 min達到峰值，持續(xù)2～6 h，且不影響外周血糖和胰島素濃度[18]。經(jīng)鼻腦靶向胰島素治療，能有效糾正疾病狀態(tài)下大腦的胰島素信號降低，是腦內(nèi)胰島素補充最為便捷有效的方式，在神經(jīng)精神領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。TLR4的高表達因是腦出血患者預(yù)后差的獨立危險因素而成為腦出血的治療靶標。本研究主要觀察經(jīng)鼻腦靶向胰島素治療是否對自體血小鼠腦出血模型NF-κB和TLR4 mRNA和蛋白表達水平的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，腦出血后不同時間點NF-κB和TLR4蛋白和mRNA表達水平增高，在模型第3天達高峰。近年的研究認為，腦出血后NF-κB和TLR4表達上調(diào)與腦出血病理生理機制相關(guān)[7，19]。腦出血后小膠質(zhì)細胞激活TLR4，爾后通過上調(diào)其下游核轉(zhuǎn)錄因子(NF-kB)的表達、調(diào)控TNF-α等多種炎性因子釋放，進而加重腦出血后繼發(fā)性腦損傷[20- 21]。經(jīng)鼻胰島素降低腦內(nèi)的氧化應(yīng)激并激活抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)，同時，在氧化應(yīng)激情況下，胰島素可以增加腦內(nèi)尿酸的水平、調(diào)節(jié)谷胱甘肽過氧化物酶及谷胱甘肽還原酶的活性，從而對氧化應(yīng)激產(chǎn)生保護作用[22]。此外，腦內(nèi)胰島素對腦內(nèi)β樣淀粉蛋白沉積和缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元損害均具有保護作用[23-24]。Ferreira等[25]的研究證實，阿爾茲海默氏病(AD)和代謝紊亂相關(guān)，大腦炎癥可通過破壞胰島素信號而嚴重影響神經(jīng)元功能。鼻內(nèi)胰島素可經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子(FOXO3)影響海馬的突觸的可塑性，進而改善AD患者的記憶、認知功能和神經(jīng)病理損害[26]。

綜上所述，鼻內(nèi)胰島素治療小鼠腦出血后TLR4表達下調(diào)，并伴有NF-kB降低。鼻內(nèi)胰島素可能通過糾正腦出血創(chuàng)傷和顱內(nèi)血腫導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷后大腦胰島素信號紊亂，從而改善中樞胰島素抵抗相關(guān)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)和TLR4及下游信號的表達異常。所以，經(jīng)鼻腦靶向胰島素治療可能是有效的干預(yù)腦出血后TLR4靶標的一種新措施。