NMDA 受體在抗NMDA 受體腦炎患者卵巢畸胎瘤組織中的表達(dá)特點(diǎn)及意義

王觀鳳 鄭麗嬌 黃潔 彭冬先

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院婦產(chǎn)科（廣州510220）

抗N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體腦炎是一種自身免疫相關(guān)的邊緣葉副腫瘤性腦炎，是目前最常見(jiàn)的腦炎類型之一?？筃MDA受體腦炎最早于2007年由DALMAU 等［1］首次診斷，至今仍無(wú)統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，目前臨床主要在排除其他類型腦炎的基礎(chǔ)上根據(jù)患者臨床癥狀以及腦脊液和（或）血清中抗NMDA 受體抗體的發(fā)現(xiàn)進(jìn)行臨床確診［2-3］。該腦炎病因不明確，可能與腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、脫髓鞘性疾病、內(nèi)分泌因素、性別、基因遺傳因素等相關(guān)。其中，有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)女性抗NMDA 受體腦炎與卵巢畸胎瘤相關(guān)性大［4-5］，然而，卵巢畸胎瘤與抗NMDA 受體腦炎的發(fā)生機(jī)制目前仍是未完全明確的。對(duì)此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為其最可能的發(fā)病機(jī)制是卵巢畸胎瘤中神經(jīng)組織異位表達(dá)NMDA 受體，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗NMDA 受體抗體，最終導(dǎo)致抗NMDA 受體腦炎的發(fā)生。然而卵巢畸胎瘤作為一種女性常見(jiàn)卵巢腫瘤，其并發(fā)抗NMDA受體腦炎者卻十分罕見(jiàn)，且部分卵巢畸胎瘤組織中并未含有神經(jīng)組織。此外，正常情況下，NMDA受體大量表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞膜表面［6］，發(fā)揮細(xì)胞信號(hào)傳遞、突觸重塑等作用，其在卵巢畸胎瘤組織中的表達(dá)及作用均不明確?？傮w而言，目前抗NMDA 受體腦炎的發(fā)生與卵巢畸胎瘤的存在尚缺乏明確的定論，有關(guān)于巢畸胎瘤組織中NMDA受體表達(dá)情況的研究更是少見(jiàn)。因此，本研究擬采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)抗NMDA 受體在合并抗NMDA 受體腦炎患者的卵巢畸胎瘤組織中的表達(dá)情況，研究卵巢畸胎瘤組織中NMDA 受體的表達(dá)特點(diǎn)及其與抗NMDA 受體腦炎的發(fā)病關(guān)系，進(jìn)一步驗(yàn)證抗NMDA 受體腦炎與卵巢畸胎瘤兩者的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象收集2014年7月至2018年7月期間，在南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院治療的具有完整臨床病理及隨訪資料的抗NMDA 受體腦炎合并卵巢畸胎瘤患者病例。明確診斷抗NMDA 受體腦炎，同時(shí)合并卵巢畸胎瘤并行卵巢畸胎瘤切除手術(shù)。共8 例患者符合標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組選取同期我院不伴有抗NMDA 受體腦炎的單純卵巢畸胎瘤組織40 例（含有神經(jīng)組織者20 例、不含神經(jīng)組織者20 例）及正常卵巢組織20 例（來(lái)源于子宮肌瘤或腺肌瘤手術(shù)切除的卵巢）。各組臨床資料具有可比性。分組情況：A 組：腦炎組卵巢畸胎瘤組織；B 組：非腦炎組畸胎瘤組織（含神經(jīng)組織）；C 組：非腦炎組畸胎瘤組織（不含神經(jīng)組織）；D 組：正常卵巢組織。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑兔抗人NMDAR 多克隆抗體（一抗）購(gòu)自美國(guó)Affinity Biosciences 公司（親和生物公司），羊抗兔IgG 抗體（二抗）、即用型SP 試劑盒、DAB 顯色試劑盒、PBS 液等均購(gòu)自上海然泰生物科技有限公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法采用免疫組織化學(xué)染色法。所有標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林浸泡固定，石蠟包埋組織，4 μm 厚連續(xù)切片，進(jìn)一步免疫組織化學(xué)染色和HE染色。NMDAR多克隆抗體工作液濃度為1∶100，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫組化染色，用已知陽(yáng)性片作為對(duì)照，以PBS液染色結(jié)果作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定采取人工計(jì)數(shù)分析的方法統(tǒng)計(jì)分析免疫組化結(jié)果，以細(xì)胞膜及細(xì)胞漿出現(xiàn)紅棕色顆粒為NMDA 受體陽(yáng)性染色。每張切片隨機(jī)觀察5 個(gè)高倍視野（× 400），每個(gè)視野觀察100 個(gè)細(xì)胞。匯總切片中陽(yáng)性細(xì)胞占所觀察細(xì)胞總數(shù)的百分比及陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度兩項(xiàng)指標(biāo)情況，半定量判斷結(jié)果。根據(jù)顯色程度判斷陽(yáng)性強(qiáng)度：無(wú)特異性著色0 分，淺棕色1 分，棕黃色2 分，深紅棕色3 分。染色陽(yáng)性細(xì)胞所占比例按下列標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定：陽(yáng)性細(xì)胞≤10%為0 分，11%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分。兩種評(píng)分方法得分相乘作為結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：0～1 分（-），2 分（+），3～4 分（++），5 分以上（+++），積分＜2為陰性，≥2 為陽(yáng)性，≥5 分為強(qiáng)陽(yáng)性。結(jié)果判定由兩位病理科醫(yī)師按照雙盲、獨(dú)立的原則進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)百分比表示，計(jì)數(shù)資料比較采用Fisher精確概率檢驗(yàn)法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NMDA 受體在卵巢畸胎瘤組織中表達(dá)的一般特點(diǎn)（圖1）NMDA 受體在卵巢畸胎瘤組織上的陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞膜及細(xì)胞漿呈現(xiàn)紅棕色染色，染色程度越深提示該受體表達(dá)量越大。該受體大部分集中表達(dá)于卵巢畸胎瘤組織中的鱗狀上皮組織，少部分位于腺上皮組織中，其中基底層組織表達(dá)量最高。此外，各組卵巢畸胎瘤組織中神經(jīng)組織及正常卵巢組織均未見(jiàn)明顯NMDA 受體陽(yáng)性表達(dá)。

2.2 NMDA受體在不同卵巢組織中的表達(dá)差異NMDA 受體在腦炎組卵巢畸胎瘤組織陽(yáng)性表達(dá)率為87.5%（7/8），強(qiáng)陽(yáng)性率為50%；在非腦炎組卵巢畸胎瘤組織（含神經(jīng)組織）中的陽(yáng)性表達(dá)率為60.0%（12/20），強(qiáng)陽(yáng)性率為5%；在非腦炎組卵巢畸胎瘤組織（不含神經(jīng)組織）中的陽(yáng)性率為55.0%（11/20），強(qiáng)陽(yáng)性率為5%；在正常卵巢組織中無(wú)表達(dá)。見(jiàn)表1、圖1。4 組卵巢組織中NMDA 受體表達(dá)的比較，經(jīng)Fisher′精確概率法計(jì)算P = 0.001（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

抗NMDA 受體腦炎是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型邊緣葉副腫瘤性腦炎，是目前最常見(jiàn)的腦炎類型之一。2007年DALMAU 等［1］在一組合并有卵巢良性畸胎瘤的年輕女性腦炎患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了抗NMDA 抗體，并提出了抗NMDA 受體腦炎的疾病診斷。該腦炎是一種亞急性起病的炎癥性腦病，多表現(xiàn)為短時(shí)記憶喪失、癲癇、精神障礙等，嚴(yán)重可導(dǎo)致昏迷、中樞性呼吸衰竭等，多累及邊緣系統(tǒng)［7］。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于該腦炎相關(guān)的研究日漸增多，但其發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，可能的原因包括腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、脫髓鞘性疾病、內(nèi)分泌因素、性別、基因遺傳因素等。目前普遍認(rèn)為抗NMDA 受體腦炎是一種抗NMDA 受體抗體免疫介導(dǎo)而產(chǎn)生神經(jīng)精神系統(tǒng)癥狀的自身免疫性腦炎，抗NMDA 受體抗體的產(chǎn)生及其與NMDA 受體復(fù)合物的抗原抗體反應(yīng)是該腦炎的病理基礎(chǔ)。

表1 NMDA 受體在不同卵巢組織中的表達(dá)情況（人工計(jì)數(shù)法）Tab.1 Expression of NMDA receptors in different ovarian tissues（Manual Counting）

圖1 NMDA 受體在不同卵巢組織中的表達(dá)情況（SP×400）Fig.1 Expression of NMDA receptors in different ovarian tissues（SP×400）

NMDA 受體復(fù)合物是一種配體門(mén)控離子通道受體，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是海馬及大腦皮層［6］。該復(fù)合物由多種亞基及亞型組成，包括NR1、NR2A-D 和NR3A-B 等，可提供諸多配體的結(jié)合位點(diǎn)，具有細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)、突觸傳遞、突觸可塑等作用。在不同的神經(jīng)精神疾病中，NMDA 受體復(fù)合物的功能狀態(tài)不同［8］。在癲癇、腦卒中、老年癡呆、帕金森病等疾病中，NMDA 受體復(fù)合物多處于過(guò)度激活狀態(tài)；而在精神分裂癥中，NMDA 受體復(fù)合物的功能則處于抑制狀態(tài)?？筃MDA 受體腦炎的主要致病原因就在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中抗NMDA 受體抗體免疫介導(dǎo)引起的NMDA 受體復(fù)合物的減少及功能抑制，NMDA受體復(fù)合物進(jìn)行性缺失可能是該腦炎患者疾病進(jìn)展的重要原因。

目前，多數(shù)研究結(jié)果提示女性抗NMDA 受體腦炎與卵巢畸胎瘤有關(guān)［4-5］。普遍認(rèn)可的發(fā)病機(jī)制是卵巢畸胎瘤中的神經(jīng)組織異位過(guò)表達(dá)NMDA受體，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗NMDA 受體抗體，在適宜的條件下作用于神經(jīng)系統(tǒng)NMDA 受體復(fù)合物，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NMDA 受體的進(jìn)行性缺失，從而引起相應(yīng)的神經(jīng)精神癥狀。2008年DALMAU 等［9］用患者自身抗體和NR2B 或NR2A 特異性抗體對(duì)5 例抗NMDA 受體腦炎患者的畸胎瘤組織免疫組化染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與神經(jīng)組織的部位一致。隨后SEKI 等［10］實(shí)驗(yàn)得到了相似的結(jié)果。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)均表明卵巢畸胎瘤可表達(dá)NMDA 受體，并可能參與了抗NMDA 受體腦炎的發(fā)生發(fā)展。本研究免疫組織化學(xué)方法結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦炎組及非腦炎組卵巢畸胎瘤組織均可見(jiàn)NMDA 受體陽(yáng)性表達(dá)，其中NMDA 受體在腦炎組卵巢畸胎瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)87.5%，明顯高于其在非腦炎組卵巢畸胎瘤（60.0%）及正常卵巢組織中（0%）的表達(dá)。該結(jié)果側(cè)面驗(yàn)證了NMDA 受體腦炎與卵巢畸胎瘤的密切相關(guān)，這與國(guó)內(nèi)外大部分文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。然而也進(jìn)一步提示了，卵巢畸胎瘤組織中高表達(dá)的NMDA 受體可能參與了抗NMDA 受體腦炎的發(fā)生，單純畸胎瘤的存在或者其中NMDA 受體的陽(yáng)性表達(dá)均不一定導(dǎo)致抗NMDA 受體腦炎的發(fā)生。

與TABATA 等［11］、CLARK 等［12］研究結(jié)果一樣，本研究腦炎組及非腦炎組卵巢畸胎瘤中均可見(jiàn)NMDA 受體陽(yáng)性表達(dá)，可見(jiàn)卵巢畸胎瘤的存在及其中抗NMDA 受體的存在并非抗NMDA 受體腦炎發(fā)病的單一致病因素。國(guó)外大部分研究發(fā)現(xiàn)卵巢畸胎瘤組織中NMDA 受體陽(yáng)性染色多位于神經(jīng)組織中［9-10］，認(rèn)為卵巢畸胎瘤中神經(jīng)組織是主要的抗原提呈部位。TABATA 等［11］、DABNER 等［13］發(fā)現(xiàn)合并抗NMDA 受體腦炎的卵巢畸胎瘤存在較顯著的瘤內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，同樣主要位于成熟的神經(jīng)組織中。此外，2014年CLARK 等［12］研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純畸胎瘤組織及合并抗NMDA 受體腦炎卵巢畸胎瘤的中鱗狀上皮組織均可表達(dá)大量的NMDA 受體。本研究中，腦炎組及非腦炎組所有卵巢畸胎瘤組織的鱗狀上皮組織均可見(jiàn)NMDA 受體陽(yáng)性表達(dá)，且基底層細(xì)胞NMDA 受體表達(dá)量最高。另外，本研究?jī)山M畸胎瘤組織中的神經(jīng)組織成分均未見(jiàn)明確的NMDA 受體陽(yáng)性表達(dá)，且并無(wú)特異性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)表現(xiàn)，這與國(guó)外大多數(shù)文獻(xiàn)結(jié)果有所不同，與CLARK 等［12］研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果提示，或者卵巢畸胎瘤組織中的鱗狀上皮組織才是真正產(chǎn)生NMDA 受體并最終導(dǎo)致抗NMDA 受體腦炎發(fā)生的主要部位。由于本研究例數(shù)較少，且尚缺乏鱗狀上皮組織及神經(jīng)組織表達(dá)情況的對(duì)比，鱗狀上皮組織是否是真正的抗原提呈部位，尚需進(jìn)一步的深入研究。大部分文獻(xiàn)［9］均提示抗NMDA 受體腦炎患者中，合并卵巢畸胎瘤者預(yù)后好，復(fù)發(fā)率低，大部分患者在切除卵巢畸胎瘤后腦炎癥狀可見(jiàn)明顯的好轉(zhuǎn)［10，14］。此外，國(guó)內(nèi)外均可見(jiàn)隱匿性卵巢畸胎瘤切除術(shù)后抗NMDA 受體腦炎病情好轉(zhuǎn)的報(bào)道［15］。本研究中8 例患者在行卵巢畸胎瘤切除后病情均有明顯改善，恢復(fù)快，預(yù)后良好。本研究結(jié)果在探討畸胎瘤組織中NMDA 受體表達(dá)與抗NMDA 受體腦炎的關(guān)系上，進(jìn)一步驗(yàn)證了卵巢畸胎瘤與該腦炎的相關(guān)性。進(jìn)一步肯定了抗NMDA 受體腦炎手術(shù)探查卵巢畸胎瘤的意義，尤其是單純內(nèi)科免疫治療效果不理想的情況下。

綜上所述，抗NMDA 受體腦炎病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制不明確。女性抗NMDA 受體腦炎與卵巢畸胎瘤密切相關(guān)，卵巢畸胎瘤組織NMDA 受體高表達(dá)可能是卵巢畸胎瘤引起該腦炎的發(fā)病機(jī)制。臨床上可疑或明確抗NMDA 受體腦炎患者，需盡快完善婦科卵巢腫瘤檢查，發(fā)現(xiàn)卵巢畸胎瘤者建議手術(shù)切除腫瘤。此外，哪些卵巢畸胎瘤患者未來(lái)發(fā)生抗NMDA 受體腦炎的風(fēng)險(xiǎn)高，檢測(cè)卵巢畸胎瘤組織中NMDA 受體表達(dá)情況或有一定的識(shí)別及預(yù)測(cè)作用。