幽門螺桿菌感染者外周血CD4+T 細(xì)胞中Notch1 mRNA 的表達(dá)及其意義

謝金玲 溫俊杰 羅美群 胡冰心 吳丹琳 葉建斌 林彥青 寧云山 李妍

南方醫(yī)科大學(xué)檢驗與生物技術(shù)學(xué)院（廣州510515）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）定植于胃黏膜，引起胃部炎癥反應(yīng)，若持續(xù)存在感染，可加重胃黏膜的炎癥反應(yīng)，引發(fā)一系列的胃腸道疾病，甚至引起機(jī)體其他系統(tǒng)的病變［1-3］。在H.pylori 感染過程中，CD4+T 細(xì)胞主要分化成分泌IFN-γ 的Th1 細(xì)胞以抵御病原菌的感染［4］，特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet 基因是Th1 細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子，促進(jìn)IFN-γ因子的分泌［5］。近年來研究［6-8］表明，Notch1 在CD4+T 細(xì)胞向Th1 細(xì)胞極化過程中起重要調(diào)節(jié)作用并在一些感染性疾病中得到證實。因此，筆者推測Notch1 受體信號參與了H.pylori 感染誘導(dǎo)的CD4+T 細(xì)胞向Th1 細(xì)胞分化的過程。

H.pylori 感染率高，根除難，易復(fù)發(fā)，依然是全球的一大難題。因此，對H.pylori 感染后機(jī)體的免疫應(yīng)答規(guī)律進(jìn)行深入的研究并有效控制H.pylori的感染具有重大的社會和經(jīng)濟(jì)意義。目前，國內(nèi)外關(guān)于Notch1 在H.pylori 感染者中的表達(dá)尚無報道。本研究通過測定CD4+T 細(xì)胞中Notch1、T-bet的mRNA 表達(dá)及血漿中IFN-γ因子的含量，分析Notch1 在H.pylori 感染時是否參與Th1 細(xì)胞的分化相關(guān)，為深入探究Notch信號通路參與Th1細(xì)胞的抗H.pylori感染的作用機(jī)制提供實驗思路，未來或有望以Notch1 為靶點治療H.pylori 的感染，為臨床治療H.pylori感染提供新思路，有效控制H.pylori的感染。

1 資料與方法

1.1 一般資料入選標(biāo)準(zhǔn)：選取江門市新會區(qū)人民醫(yī)院2018年4～10月消化內(nèi)科收治的在胃鏡下于胃竇鉗取組織作快速尿素酶試驗（試紙法），同時做14C 尿素呼氣試驗，兩者同時為陽性則判為H.pylori 陽性，兩者同時為陰性者判為H.pylori 陰性，其他情況排除出實驗。感染程度以14C 尿素呼氣試驗的dpm 值來判定。其中確認(rèn)為H.pylori 感染的患者37 例，男26 例，女11 例，年齡23～86 歲，平均（58.95±2.153）歲。其中陰性的健康者35 例，男21 例，女14 例，年齡23～80 歲，平均（53.63 ±2.584）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：檢查前1～2周內(nèi)曾服用過質(zhì)子泵抑制劑（PPI）或抗生素的患者；患有其他嚴(yán)重慢性疾病的患者。本研究已通過江門市新會區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象已知情并簽署知情同意書。兩組別在性別、年齡等一般資料方面比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 主要材料及試劑Ficoll-Paque PLUS 淋巴分離液（Cat#71716700AG，GE Healthcare）；CD4+T 細(xì)胞分離試劑盒（Cat#MB17-R0034，MiltenyiBiotec）；RNAiso Plus 提取試劑（Cat#9109，Takara）；HiScript?ⅡQRTSuperMixforqPCR（+gDNAwiper）RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Cat#R223-01，Vazyme）；ChamQTMSYBR?qPCR Master Mix（Low Rox Premixed）QPCR 熒光定量試劑盒（Cat#Q331-01，Vazyme）；Human Interferon γ（IFN-γ）ELISA Kit 定 量 試 劑 盒（Cat#CSBE04577h，CUSABIO Biotech）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集及處理所有受試病例采靜脈肝素抗凝血5 mL?？鼓入x心吸取上層血漿用于檢測血漿IFN-γ 因子含量，剩余血樣用等量生理鹽水稀釋，采用Ficoll 密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞（peripheral bloodmononuclear cells，PBMC），分離出來的細(xì)胞再用美天旎磁珠分離出CD4+T 細(xì)胞，1 mL PBS 重懸，取20 μL 稀釋4 倍，上機(jī)計數(shù)單個核細(xì)胞，CD4+T 細(xì)胞占比均在90%以上，其余細(xì)胞離心后-80 ℃凍存至RNA 提取。

1.3.2 qRT-PCR 檢測Notch1 和T-bet 的mRNA 表達(dá)Trizol 法提取各樣本總RNA，以500 ng RNA 為模板，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA 第1條鏈，反應(yīng)條件：50 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃保存。應(yīng)用熒光定量試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，按照以下組分配制real time-PCR 反應(yīng)體系：10 μL 2× ChamQ SYBR qPCR Master Mix（Low ROX Premixed），0.4 μL Forward primer（10 μmol/L），0.4 μL Reverse primer（10 μmol/L），1 μL cDNA，加ddH2O至20 μL 體系。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，在95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40 個循環(huán)，最后在95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s 形成熔解曲線。測試時均做3 個復(fù)孔，所測基因均用β-actin 作內(nèi)參，用2-△△CT方法計算目的基因相對表達(dá)量。人Notch1 受體和β-actin 引物由本實驗室前期研究設(shè)計，T-bet 轉(zhuǎn)錄因子的引物參考Nogueira 文獻(xiàn)報道［9］，以上引物在廣州艾基生物公司進(jìn)行合成。詳細(xì)引物序列見表1。

表1 Notch1、T-bet、β-actin 的qRT-PCR 引物Tab.1 Sequence of primers

1.3.3 ELISA法定量檢測血漿IFN-γ因子ELISA法定量檢測血漿IFN-γ 因子，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作，設(shè)8 個標(biāo)準(zhǔn)品，濃度值分別為0、6.25、12.5、25、50、100、200、400 pg/mL，測定波長為450 nm，均設(shè)3 個復(fù)孔，根據(jù)各個標(biāo)準(zhǔn)品所測OD 均值，利用CurveExpert1.4 軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，并以樣本OD 均值計算出樣本濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用GraphPad Prism 6.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。各項計量指標(biāo)以（± s）表示，樣本差異檢驗采用獨立樣本t 檢驗，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H.pylori 感染者CD4+T 細(xì)胞中Notch1 mRNA表達(dá)高于健康者為了比較H.Pylori 感染者與健康體檢者CD4+T 細(xì)胞中Notch1 mRNA 的表達(dá)水平差異，利用qPCR 進(jìn)行檢測。見圖1，與對照組中Notch1 mRNA 的表達(dá)水平（1.107±0.066 8，n=35）相比較，H.Pylori 感染組中Notch1mRNA 的表達(dá)水平（3.154 ± 0.423 6，n = 37）明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.000 1）。

圖1 Notch1 在正常人及H.pylori 感染者CD4+T 細(xì)胞中mRNA 的表達(dá)水平Fig.1 The expression of Notch1 mRNA in CD4+T cell of Normal subjects and H.pylori-infected patients

2.2 H.pylori 感染者CD4+ T 細(xì)胞中T-bet mRNA的表達(dá)高于健康者為了比較H.Pylori 感染者與健康體檢者CD4+T 細(xì)胞中T-bet mRNA 的表達(dá)水平差異，利用Q-PCR進(jìn)行檢測。見圖2，與對照組中T-bet mRNA 的表達(dá)水平（1.178 ± 0.101 7，n = 35）相比較，H.Pylori 感染組中T-bet mRNA 的表達(dá)水平（1.793 ± 0.244 6，n = 37）升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。

圖2 T-bet 在正常人及H.pylori 感染者CD4+T 細(xì)胞中mRNA 的表達(dá)水平Fig.2 The expression of T-bet mRNA in CD4+T cell of Normal subjects and H.pylori-infected patients

2.3 H.pylori 感染者血漿中IFN-因子含量高于健康者為了比較H.Pylori 感染者與健康體檢者血漿中IFN-γ因子的含量水平差異，利用ELISA 法進(jìn)行定量檢測。見表2，與對照組中IFN-γ因子的含量水平［（222.8 ± 45.56）pg/mL，n = 35］相比較，H.Pylori 感染組中IFN-γ 因子的含量水平［（986.7 ± 187.3）pg/mL，n = 37］明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。

表2 血漿IFN-γ 因子在正常人及H.pylori 感染者中的含量水平Tab.2 The concentration of the IFN-γ in blood plasma of Normal subjects and H.pylori-infected patients ±s

表2 血漿IFN-γ 因子在正常人及H.pylori 感染者中的含量水平Tab.2 The concentration of the IFN-γ in blood plasma of Normal subjects and H.pylori-infected patients ±s

對照組H.pylori 感染組例數(shù)35 37 IFN-γ濃度（pg/mL）222.8±45.56 986.7±187.3 P 值＜0.05

2.4 H.pylori 感染組中T-bet mRNA 的表達(dá)與Notch1 mRNA 的表達(dá)呈正相關(guān)以上實驗表明，H.pylori感染者CD4+T細(xì)胞中Notch1 mRNA和T-bet mRNA 表達(dá)都高于對照組，為了進(jìn)一步評估T-bet的表達(dá)與Notch1 的表達(dá)是否相關(guān)，利用Pearson 相關(guān)分析對它們的表達(dá)進(jìn)行評估。見圖3，H.pylori感染組中T-bet mRNA 的表達(dá)水平與Notch1 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.558 6，P ＜0.000 1）。

圖3 H.pylori 感染者CD4+T 細(xì)胞中T-bet 與Notch1 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性Fig.3 The correlation between the expression of T-bet and Notch1 mRNA in CD4+T cell of H.pylori-infected patients

2.5 H.pylori 感染組中血漿IFN-γ 因子含量與Notch1 mRNA 的表達(dá)水平的相關(guān)性以上實驗表明，H.pylori 感染者中Notch1 mRNA 和IFN-γ因子的表達(dá)都高于對照組，為了進(jìn)一步評估IFN-γ因子的含量與Notch1 mRNA 的表達(dá)是否相關(guān)，利用Pearson 相關(guān)分析對它們的表達(dá)進(jìn)行評估。結(jié)果顯示IFN-γ因子的分泌與Notch1 的表達(dá)沒有相關(guān)性（P ＞0.05）。

3 討論

已有的研究表明，細(xì)胞因子環(huán)境在CD4+T 細(xì)胞分化過程中決定著分化的方向［10-11］，但細(xì)胞因子作用模式并不能完全詮釋病原體誘導(dǎo)CD4+T 細(xì)胞分化的機(jī)制，其他信號分子也參與調(diào)控CD4+T細(xì)胞的分化進(jìn)程。因此，探索參與H.pylori 感染誘導(dǎo)CD4+T 細(xì)胞分化的信號傳導(dǎo)通路，有助于理解抗H.pylori 感染的宿主防御機(jī)制及CD4+T 細(xì)胞的分化過程。

Notch 信號通路是一種高度保守的信號傳導(dǎo)路徑，廣泛存在于細(xì)胞表面，在細(xì)胞的發(fā)育過程中決定細(xì)胞不同的分化方向，維持細(xì)胞的增殖、分化和凋亡的平衡。哺乳動物有4 種Notch 受體（Notch1-4）和5 種Notch 配體（Delta-like1，3，4，Jagged1和Jagged2）。Notch受體與配體結(jié)合后，胞內(nèi)段在近膜處經(jīng)γ-分泌酶（γ-secretase）的水解，Notch 受體胞內(nèi)區(qū)（Notch intracellular domain，NICD）脫離，NICD 是Notch 受體的活化形式，其進(jìn)入細(xì)胞核與核結(jié)合蛋白CSL（CBF1 suppressor of hairless-Lag1，CSL）結(jié)合，激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。

已有研究［12］表明，Notch 信號通路在多種免疫細(xì)胞的分化中起重要作用，如參與CD4+T 細(xì)胞亞群的分化［13-14］，決定CD4+T 細(xì)胞的存活［15］，維持記憶性CD4+T 細(xì)胞的功能［15］，阻止CD4+T 細(xì)胞的凋亡［16］，初始CD4+T 細(xì)胞的表面可以檢測到低水平的Notch1 和Notch2 的表達(dá)，經(jīng)T 細(xì)胞受體（T cell receptor TCR）活化后CD4+T 細(xì)胞表面表達(dá)Notch信號通路的所有受體［17］。綜上所述，Notch 信號通路參與CD4+T 細(xì)胞分化過程并發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

近年來研究表明，Notch1 在CD4+T 細(xì)胞向Th1細(xì)胞極化過程中起重要調(diào)節(jié)作用［18］。Notch1 和Notch2 基因缺陷的小鼠不能分泌INF-γ，從而不能抵抗利士曼原蟲的感染［19］。再生障礙性貧血患者的外周血單核細(xì)胞中NICD1（Notch1 的活化形式）與TBX21（T-bet 的編碼基因）的啟動子結(jié)合，調(diào)節(jié)Th1 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［20］。新型隱球菌在肺部的感染過程中，Notch 信號缺失的情況下，INF-γ的分泌減少，保護(hù)性Th1 型反應(yīng)明顯受損［7］。在體內(nèi)外CD4+T 細(xì)胞分化過程中加入GSI（γ-secretase 分泌酶抑制劑，抑制Notch 信號通路）后，轉(zhuǎn)錄因子T-bet 的表達(dá)降低，INF-γ的分泌減少，從而抑制Th1 細(xì)胞的分化［21-22］。阻斷Notch1 信號通路可增強(qiáng)慢性乙型肝炎患者Th1 細(xì)胞免疫反應(yīng)，這可能與慢性乙肝患者機(jī)體的免疫耐受相關(guān)［23］?？梢姡琋otch 信號通路參與CD4+T 細(xì)胞分化成Th1 細(xì)胞。有研究表明以Notch 信號通路為靶標(biāo)，可以有效防治一些炎性疾病。如用GSI 可以減輕Th1 介導(dǎo)的多發(fā)性硬化模型-小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）、膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）和再生障礙性貧血的癥狀［21-22，24］。綜上所述，Notch 信號通路參與了Th1 細(xì)胞的分化并為一些炎癥性疾病的治療提供新思路。H.pylori 感染引起宿主CD4+T 細(xì)胞主要分化成分泌IFN-γ的Th1 細(xì)胞，抵御病原菌的感染［25］，但關(guān)于Notch 信號是否參與調(diào)控H.pylori 感染引起的Th1 細(xì)胞的分化，目前尚未見文獻(xiàn)報道，因此探討這方面的研究必將加深人們對H.pylori 感染的認(rèn)知。

在本研究中，H.pylori 感染者CD4+T 細(xì)胞中Notch1 mRNA 的表達(dá)量明顯比未感染者升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明Notch1 在機(jī)體對抗H.pylori感染中發(fā)揮一定的作用。另外，H.pylori 感染組中T-bet mRNA 的表達(dá)水平高于健康對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，這一結(jié)果表明，在H.pylori 感染后，機(jī)體存在著Th1 細(xì)胞分化的加強(qiáng)。隨后發(fā)現(xiàn)，H.pylori 感染者血漿中IFN-γ的表達(dá)高于未感染者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這一結(jié)果更加證實了H.pylori 的感染誘導(dǎo)Th1 細(xì)胞的分化。這結(jié)果與WEN 等［26］報道的肝纖維化的組織學(xué)分期與肝內(nèi)T-bet+Th1 細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)（r = 0.685）相似，肝內(nèi)Th1 細(xì)胞與肝纖維化進(jìn)程有關(guān)，提示著T-bet+Th1細(xì)胞與抗H.pylori的感染有關(guān)。同時，對H.pylori感染者T-bet 與Notch1 的表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示H.pylori 感染組中T-bet mRNA 表達(dá)水平與Notch1 mRNA 表達(dá)水平呈正相關(guān)（r = 0.558 6，P ＜0.000 1），提示著Notch1 參與了CD4+T 細(xì)胞向Th1 細(xì)胞的分化，從而促進(jìn)了Th1 細(xì)胞抗H.pylori的感染。雖然H.pylori 感染者CD4+T 細(xì)胞中IFN-γ的表達(dá)高于未感染者，但血漿IFN-γ因子含量與Notch1 mRNA 的表達(dá)水平無相關(guān)性，這提示著血漿中IFN-γ因子的分泌，并非完全依賴于Notch1信號通路，還有其他的信號路徑參與了IFN-γ因子的分泌，抵御機(jī)體抗H.pylori 感染。這結(jié)果與AUDERSET 等［19］的研究結(jié)果接近，缺乏Notch1 基因的耐利士曼原蟲感染的小鼠，感染利什曼原蟲后同樣可引起高IFN-γ水平的保護(hù)性Th1 反應(yīng)，證明Notch1 并不是Th1 分化過程的唯一關(guān)鍵因素。

綜上所述，Notch1 在H.pylori 感染時升高，Tbet 的表達(dá)也升高，且兩者呈正相關(guān)關(guān)系，說明Notch1 信號通路在抗H.pylori 感染中參與了CD4+T細(xì)胞向Th1 細(xì)胞的分化過程，發(fā)揮了一定的作用，但其并非為分泌IFN-γ因子抵御H.pylori 感染的唯一信號傳導(dǎo)通路。因此，探索與分泌IFN-γ因子密切相關(guān)的路徑，及其與H.pylori 感染的不同炎癥程度，及其與胃癌發(fā)展的相關(guān)機(jī)制等問題仍需要進(jìn)行深入地研究，以達(dá)到有效防治H.pylori感染。