硒化荷葉離褶傘菌絲體的鑒定及生物活性

周志強，樓海軍*

華寶香精股份有限公司上海分公司（上海 201821）

荷葉離褶傘（Lyophyllum decastes（Fr.）Singer），傘菌目、白蘑科、離褶傘屬菌類植物，其分布在江蘇、廣西、青海、云南、甘肅、西藏、新疆等地區(qū)，可食用，味道鮮美，屬優(yōu)良食用菌。荷葉離褶傘菌絲體具有一定的富硒能力，在富硒的發(fā)酵過程中，硒的加入可有效提高菌絲體的干質量[1-3]。

細胞中的氧自由基被認為是導致多種疾病的原因，如癌變、動脈粥樣硬化、癌癥、類風濕關節(jié)炎等?？寡趸瘎┌ǘ喾雍投嗵?，能有效清除自由基，適當保護機體，防止生物氧化損傷和老化。荷葉離褶傘菌絲體中的多糖已被證明是一種有效的抗氧化劑[4-5]。

硒（Se）是一種人體必需的微量元素，是一種活躍的微量元素。硒元素通過多種硒依賴性的酶和具有抗氧化功能的硒蛋白參與動物、人體生理活動[6-8]。人們普遍認為有機硒化合物毒性較低，與無機硒相比，其生物利用度和生物功能均較高。富硒食物，例如富硒酵母、富硒茶及富硒顆粒，一般都是適宜食用的。硒化荷葉離褶傘菌絲體作為硒膳食補充劑的主要來源。利用硒技術進行微生物發(fā)酵，為生產有機硒化合物提供了一種可行、經濟的途徑。荷葉離褶傘菌絲體已被證明能有效地從培養(yǎng)基中吸收微量元素，因此荷葉離褶傘菌絲體是硒積累、吸收的最佳選擇之一[9]。

試驗旨在研究硒化荷葉離褶傘菌絲體的主要化學特性和抗氧化活性。此外，還研究了硒化荷葉離褶傘菌絲體對H2O2誘導的PC-12細胞毒性是否有保護作用。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌絲體原料

荷葉離褶傘菌絲體，湖北省武漢華中食用菌栽培研究所。

1.1.2 試劑

硒粉（化學純CP），國藥集團化學試劑有限公司；蒽酮（分析純），上海中泰化學試劑有限公司；3, 3’-二氨基聯苯胺（化學純），國藥集團化學試劑有限公司；95%乙醇、氯仿、正丁醇、葡萄糖、濃H2SO4、濃HCl、濃HNO3、甲苯、NaOH、EDTA-Na2，均為分析純，水為超純水。

1.1.3 主要儀器與設備

V-1200型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；SW-CJ 1 BU型超凈工作臺，蘇州新區(qū)楓橋凈化設備廠；BXM型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司；HZQ-A型恒溫培養(yǎng)振動器（搖床），常州冠軍儀器制造有限公司；FA 1104型電子天平，上海精科天美科學儀器有限公司；IEC Multi型高速離心機，美國熱電集團；RE 52 AA旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品提取純化

將脫水干燥的荷葉離褶傘菌絲體與蒸餾水混合，并在90 ℃的水中攪拌2 h，然后收集上清液并濃縮，加入4倍體積的乙醇并保持在4 ℃的溫度中放置12 h。通過4 000 r/min進行離心10 min后，獲得硒化荷葉離褶傘菌絲體沉淀，并用試劑讓其脫蛋白，用水透析后，將粗制硒化荷葉離褶傘菌絲體施加到DEAE-52 Sepharose Fast Flow離子柱（2.6 cm×40 cm）和Sephadex G-100（30 cm×2.6 cm）離子柱層析，收集一個主要部分硒化荷葉離褶傘菌絲體并凍干供進一步研究。

1.2.2 分子量分布測定

硒化荷葉離褶傘菌絲體的平均分子量通過配備有凝膠色譜柱TSK-GEL G 4000 PWXL（7.8 mm×300 mm，柱溫30 ℃）和HPGPC法進行檢測。

1.2.3 FT-IR和NMR分析

將1 mg硒化荷葉離褶傘菌絲體與150 mg干燥溴化鉀粉末研磨并壓制成顆粒，在傅里葉變換紅外分光光度計上進行吸光度模式的分析，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

將樣品溶解在D2O中，交換3次，然后凍干并重新溶解在D2O中，用分光計（600 MHz）在298 K溫度下記錄1H NMR和13C NMR圖譜。

1.2.4 單糖組成分析

樣品用三氟乙酸溶解并在110 ℃的油浴中水解5 h，然后在90 ℃下乙?；? h，將乙?；臉悠啡芙庠诙燃淄橹?，用于進一步GC分析。

1.2.5 抗氧化活性測定

參照文獻[10]并做修改測定硒化荷葉離褶傘菌絲體的DPPH自由基清除能力及羥自由基清除活性。

DPPH自由基（DPPH·）清除能力測定：用60%乙醇水溶液分別配制不同濃度的維生素C及硒化荷葉離褶傘菌絲體溶液。取0.2 mL維生素C及硒化荷葉離褶傘菌絲體溶液，分別加入至1.8 mL的DPPH乙醇溶液中（濃度為1×10-4mol/L），迅速混勻反應20～30 min，然后再以分光光度計在710 nm下測定各吸光度。DPPH的清除率按是（1）計算。

式中：D0為未加樣的DPPH乙醇溶液的吸光度；K為樣品與DPPH反應后的吸光度；K0為樣品的空白（0.2 mL+1.8 mL 60%乙醇水溶液）的吸光度。結果以三次的平均值表示。

羥自由基（·OH）清除能力的測定：以VC作陽性對照，分別測定VC及硒化荷葉離褶傘菌絲體的清除羥自由基能力。取5 mL不同濃度VC及硒化荷葉離褶傘菌絲體溶液加入試管中，分別依次加入10 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液、5 mL 9.0 mmol/L的水楊酸溶液和10 mL 0.3% H2O2溶液，迅速混勻反應20～30 min，然后再以分光光度計在510 nm下測定各吸光度。硒化荷葉離褶傘菌絲體清除率按式（2）計算。

式中：K0為空白組的吸光度（純水代替樣品）；K1為硒化荷葉離褶傘菌絲體樣品的吸光度；K2為硒化荷葉離褶傘菌絲體樣品干擾試驗的吸光度（水楊酸溶液代替FeSO4溶液和H2O2溶液）。

1.2.6 硒化荷葉離褶傘菌絲體對雙氧水損傷PC-12細胞的保護作用

將PC-12細胞以1×105mL-1的密度接種在6孔板或細胞培養(yǎng)瓶中。在暴露于濃度為400 pmol/L雙氧水之前，將細胞分別用400 pg/mL硒化荷葉離褶傘菌絲體和200 pg/mL的VC預處理24 h，使用流式細胞儀分析細胞凋亡和細胞周期，在熒光顯微鏡上觀察細胞核形態(tài)的變化。

1.2.7 統計分析

所有計算均采用IBM SPSS 22.0軟件處理，結果以平均±SD（標準差）表示。以方差分析方法確定差異；使用方差分析來確定樣本結果之間的差異。

2 結果與討論

2.1 硒化荷葉離褶傘菌絲體化學成分和單糖成分

通過熱水浸提法、80%乙醇沉淀和Sevag試劑脫蛋白，從荷葉離褶傘菌絲體的子實體中得到的硒化荷葉離褶傘菌絲體產量為5.37%，然后用DEAE-52 Sepharose Fast flow層析柱和Sephadex G-100純化。收集一個部分，命名為Se-POP-11，獲得相對高的硒化荷葉離褶傘菌絲體含量（53.68%），產率為1.27%。Se-POP-11總碳水化合物、蛋白質、糖醛酸、硫酸鹽和硒含量分別為85.26%，7.41%，1.89%，4.32%和3.21 pg/g。硒含量高于天然荷葉離褶傘菌絲體多糖，與富硒紫陽綠茶（2.14 pg/g）和硒化荷葉離褶傘菌絲體（Se-GP 33，4.50 pg/g）的硒含量相近[11-13]。

2.2 硒化荷葉離褶傘菌絲體結構鑒定結果及分析

紅外光譜通常用于鑒定硒化荷葉離褶傘菌絲體中的特征性的有機基團，Se-POP-11的紅外吸收度如圖1所示，3 339 cm-1處的吸光度帶由羥基伸展而產生，而在1 048 cm-1處有一個（COH）側鏈基團，木聚糖譜2 933 cm-1處的峰表示C—H振動，在1 606 cm-1歸因于N—H拉伸，這表明蛋白質存在于硒化荷葉離褶傘菌絲體中。紅外光譜中1 408和1 161 cm-1處的兩個伸縮峰表明存在C—O鍵，在1 408.79 cm-1處的信號表明沒有羧酸根陰離子基團（C==O）的對稱伸縮，1 078.36 cm-1被指定為吡喃糖形式的糖。這些共同的峰表明，根據其他結果，硒的引入不影響硒化荷葉離褶傘菌絲體的主要結構。發(fā)現在794 cm-1處觀察到的一個驚人的峰，在由根瘤菌合成的含硒胞外硒化荷葉離褶傘菌絲體中發(fā)生Se==O伸縮振動。觀察到的802 cm-1也可能表明Se==O存在。

核磁共振分析涉及1H NMR和13C NMR試驗，圖2用于指定重復單元中糖殘基的化學位移。對于δ 5.203處的所有殘基H-1質子的化學位移高于4.9 mg/L，這證實了端點結構與（1→4）-α-D Glcp相關。3.2～4.1 mg/L出現的化學位移被分配給原H-2至H-6的NS信號。在3.6～3.9 mg/L處的強信號也與β-吡喃半乳糖鍵的存在一致。此外在60～80 mg/L范圍內的13C NMR譜顯示C-2至C-6的碳水化合物碳信號，另外，在80～90 mg/L范圍內沒有碳信號，說明Se-PO-11不是呋喃糖。根據文獻及現有的數據，13C NMR中98～109 mg/L區(qū)域的共振歸因于硒化荷葉離褶傘菌絲體的異頭碳原子[9-10,14]。

圖2 Se-POP-11在重水中1H NMR譜（1）和13C NMR譜（2）

2.3 硒化荷葉離褶傘菌絲體生物活性測定結果及分析

圖3 SE-POP-11（1）和HPGPC標準曲線（2）圖

通過使用已知分子量的各種葡聚糖T系列標準物（log MW=8.641 4-0.380 6t，R2=0.994 5，MW為分子量，t為保留時間（min））獲得校準曲線。HPGPC曲線（圖3）表明Se-POP-11具有單一的窄的對稱峰，這表明Se-POP-11是均勻的硒化荷葉離褶傘菌絲體，平均分子量約為9.43 kDa，Se-EPS分子量為7.3 kDa，這兩個結果表明硒化荷葉離褶傘菌絲體的分子量在生物法硒化后降低。

如圖4所示，Se-POP-11的羥自由基清除活性及DPPH的清除作用在試驗劑量范圍內呈劑量依賴關系，其對羥自由基清除活性最高清除率可達94.62%。

Se-POP-11對ABTS自由基的清除能力結果如圖4所示。Se-POP-11對ABTS自由基的清除活性具有濃度依賴性，在6 mg/mL時分別為96.45%和99.56%。

圖4顯示了樣品對超氧自由基的清除能力，Se-POP-11和VC對超氧陰離子自由基的抑制能力與其濃度直接相關。當質量濃度為6 mg/mL時，Se-POP-11和VC的清除活性分別為97.49%和99.84%。據報道，富含硒的多糖具有較強的超氧自由基清除活性，其作用機理可能是硒化荷葉離褶傘菌絲體的三維結構被硒基（SeH）或硒酸酯所改變，這會影響氫原子的供體能力和抗氧化能力。否則，硒本身具有更強的抗氧化活性。

化合物的還原能力可作為潛在抗氧化活性的重要指標[5-6]。圖4顯示，Se-POP-11和VC的還原潛力通常隨著其在試驗劑量中濃度的增加而增強，當Se-POP-11質量濃度達到6 mg/mL時，Se-POP-11和VC的質量濃度分別為1.772和2.59 mg/mL，硒化荷葉離褶傘菌絲體對H2O2誘導細胞氧化有保護作用。

圖4 不同質量濃度下Se-POP-11 DPPH自由基（1）、羥自由基（2）、ABTS自由基（3）、超氧陰離子自由基（4）和還原力（5）活性圖

3 結論

綜上所述，經DEAE-52和G-100純化得到純度較高的荷葉離褶傘菌絲體Seul-11，其硒含量為3.21 pg/g，其主要成分為葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖，其摩爾比分別為5.30︰1.55︰2.14︰0.29︰0.63，平均分子量約為9.43 kDa。硒化荷葉離褶傘菌絲體對超氧陰離子自由基、羥自由基、ATBS自由基和DPPH自由基均表現出較強的清除活性，并且對H2O2誘導的PC12細胞嚴重氧化損傷具有抑制作用。以上結果表明硒化荷葉離褶傘菌絲體在體外具有有效的抗氧化性能，可以作為功能性食品成分或有機硒補充劑的藥物進行探索。對硒與硒化荷葉離褶傘菌絲體的結合形式應進行更詳細的研究，并在隨后的研究中進行抗癌等生物學功能研究。