特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉中硒測(cè)定方法探討

鄧陶陶，李清清

1. 國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心（北京 100022）；2. 上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（上海）（上海 200233）

硒是一種人體必需的微量元素，具有抗癌、抗衰老、增強(qiáng)人體免疫力、調(diào)節(jié)人體維生素吸收等作用。硒攝入不足容易引起人體免疫力下降，導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生，比如近視、白內(nèi)障、肝癌、肺癌、白血病等。人體的生理活動(dòng)需要維持一定量的硒，但也不是越多越好，日攝入量達(dá)到400 μg也會(huì)引起人體代謝功能紊亂，導(dǎo)致頭發(fā)脫落、指甲變脆易脫落、神經(jīng)系統(tǒng)異常等[1-4]。乳粉是嬰幼兒的主要食物，嬰幼兒硒含量缺乏會(huì)對(duì)其健康產(chǎn)生重大影響，特別是對(duì)體質(zhì)較輕的新生兒影響更大。美國(guó)食品和藥物管理局發(fā)布硒監(jiān)管要求中將硒確定為美國(guó)嬰兒配方食品中第30種要求強(qiáng)制添加的營(yíng)養(yǎng)元素。

目前，食品中硒的測(cè)定方法主要有原子吸收光譜法[5]、原子熒光光譜法[6]、熒光法[7]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[8-9]以及電感耦合等離子發(fā)射光譜法[10]等。其中，原子熒光光譜法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法為乳粉中較主流的測(cè)定方法。試驗(yàn)以近幾年興起的、研究度關(guān)注度較高的特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉為測(cè)定對(duì)象，對(duì)原子熒光光譜法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定硒的影響因素進(jìn)行探討，對(duì)測(cè)定結(jié)果差異性進(jìn)行分析。

1 材料與設(shè)備

Mars 6微波消解儀（美國(guó)CEM公司）；iCAP Q電感耦合等離子發(fā)射光譜質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；Miletone酸純化系統(tǒng)（意大利Miletone公司）；精控電熱爐（上海博通化學(xué)科技有限公司）。

硒單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（GSB 04-1751-2004，北京有色金屬研究院）；硝酸（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥試劑）；鹽酸（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥試劑）；硼氫化鉀（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；氫氧化鉀（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；鐵氰化鉀（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm，美國(guó)Millipore公司）；ICP-MS、調(diào)諧溶液（1 μ g/L，Ba、Be、Bi、Ce、Co、In、Li、Ni、Pb、U，美國(guó)賽默飛世爾科技公司）。乳蛋白部分水解配方、早產(chǎn)/低出生體重嬰兒配方、無(wú)乳糖配方三種特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉（某乳粉公司提供）；質(zhì)控乳粉（乳粉企業(yè)質(zhì)控樣品，某乳粉公司提供）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 原子熒光光譜法

2.1.1 樣品前處理

特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉經(jīng)搖勻后，稱取0.5 g（精確至0.000 1 g）置于微波消解管中，加入5 mL經(jīng)純化的硝酸，放在電爐上100 ℃預(yù)熱40 min，后放入微波消解儀，按照微波升溫程序進(jìn)行消解，冷卻取出，置于電熱爐上170 ℃將酸液揮發(fā)至近干（不可蒸干），加5 mL 6 mol/L鹽酸溶液，繼續(xù)加熱至酸液揮發(fā)至0.5 mL左右，冷卻，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加入2.5 mL鐵氰化鉀溶液（100 g/L），用水定容，上機(jī)檢測(cè)。同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。微波升溫程序見表1。

表1 微波消解升溫程序

2.1.2 儀器測(cè)試條件

原子熒光光譜儀參數(shù)設(shè)置：燈電壓300 V，燈電流22 mA，原子化器高度8 mm，載氣流速600 mL/min，屏蔽氣流速1 000 mL/min。讀數(shù)方式：峰面積，延遲時(shí)間1 s，讀數(shù)時(shí)間15 s。

載流：5%鹽酸；還原劑：20 g/L硼氫化鉀（用5 g/L氫氧化鉀溶液定容）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度質(zhì)量濃度：4，8，12，16和20 μ g/L。

2.1.3 樣品測(cè)定和加標(biāo)試驗(yàn)

對(duì)乳蛋白部分水解配方、早產(chǎn)/低出生體重嬰兒配方、無(wú)乳糖配方3種特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉及質(zhì)控乳粉（硒含量范圍17.11～23.23 μg/100 g，中位值20.17 μg/100 g）進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)6個(gè)平行樣。以6次平行測(cè)定結(jié)果的平均值為參考，分別對(duì)3種特殊醫(yī)學(xué)乳粉進(jìn)行等量加標(biāo)，每個(gè)加標(biāo)做2個(gè)平行樣品。

2.2 電感耦合等離子體質(zhì)譜法

2.2.1 樣品前處理

特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉經(jīng)搖勻后，稱取0.5 g（精確至0.000 1 g）置于微波消解管中，加入5 mL經(jīng)純化的硝酸，放在電爐上100 ℃預(yù)熱40 min，再放入按照微波升溫程序進(jìn)行消解，后冷卻取出，置于電熱爐上180℃將酸液揮發(fā)至0.5 mL左右，冷卻后用純水定容至10 mL，上機(jī)檢測(cè)。微波升溫程序同2.1.1。

2.2.2 儀器測(cè)試條件

載氣，高純氬氣；等離子體氣流量，14.0 L/min；載氣流速，0.80 L/min；輔助氣，1.00 L/min；采樣深度，5.0 mm；入射功率，1 550 W；檢測(cè)質(zhì)量數(shù)，m/z 78（Se）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度質(zhì)量濃度：5，10，15，20和25 μ g/L。

2.2.3 樣品測(cè)定和基質(zhì)加標(biāo)測(cè)試

對(duì)乳蛋白部分水解配方、早產(chǎn)/低出生體重嬰兒配方、無(wú)乳糖配方3種特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉及質(zhì)控乳粉（硒含量范圍17.11～23.23 μg/100 g，中位值20.17 μg/100 g）進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)6個(gè)平行樣。以6次平行測(cè)定結(jié)果的平均值為參考，分別對(duì)3種特殊醫(yī)學(xué)乳粉進(jìn)行等量加標(biāo)，每個(gè)加標(biāo)做2個(gè)平行樣品。

3 結(jié)果與討論

3.1 試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 原子熒光光譜法測(cè)定結(jié)果

三種特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉及質(zhì)控乳粉測(cè)定結(jié)果見表2，三種特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉加標(biāo)測(cè)定結(jié)果見表3。

表2 原子熒光光譜法特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉及質(zhì)控乳粉測(cè)定結(jié)果

表3 原子熒光光譜法特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉加標(biāo)回收結(jié)果

3.1.2 電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定結(jié)果

三種特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉及質(zhì)控乳粉測(cè)定結(jié)果見表4。三種特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉加標(biāo)測(cè)定結(jié)果見表5。

表4 電感耦合等離子體質(zhì)譜法特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉及質(zhì)控乳粉測(cè)定結(jié)果

表5 電感耦合等離子體質(zhì)譜法特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉加標(biāo)回收結(jié)果

3.2 討論

3.2.1 原子熒光光譜法測(cè)定的影響因素

3.2.1.1 微波消解條件的影響

試驗(yàn)分別考察了185 ℃/15 min，190 ℃/20 min，195 ℃/25 min，200 ℃/15 min和200 ℃/25 min五種不同消解條件對(duì)結(jié)果的影響。結(jié)果見圖1。

由圖1可知，隨著消解條件的增強(qiáng)，測(cè)定的結(jié)果顯著升高。分析原因：原子熒光光譜法的測(cè)定原理是先將硒還原成六價(jià)態(tài)硒，然后氫化形成氫化硒進(jìn)入儀器檢測(cè)。如果消解條件偏弱，有些硒形態(tài)鍵不能完全打開，進(jìn)而不能被還原成六價(jià)態(tài)，影響氫化硒的形成而使測(cè)定結(jié)果偏低；隨著消解條件的增強(qiáng)，樣品被消化得更完全，硒更容易形成氫化物而被檢測(cè)，從而使檢測(cè)結(jié)果升高。

圖1 微波消解條件對(duì)原子熒光光譜法測(cè)定結(jié)果的影響

在選擇消解條件時(shí)，一方面要考慮測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，另一方面要考慮試驗(yàn)效率和微波消解儀的損耗，綜合考慮選擇195 ℃/25 min為消解條件。

3.2.1.2 鹽酸加入時(shí)機(jī)的影響

試驗(yàn)分別考察了在趕酸初期、中期和酸近干時(shí)加入2 mL鹽酸對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，在酸近干時(shí)加入鹽酸，質(zhì)控樣最接近中位值，而在初期和中期加入鹽酸，測(cè)定結(jié)果均偏低。分析原因：鹽酸是將硒還原成六價(jià)態(tài)硒的關(guān)鍵試劑，而硝酸具有氧化性，如果在硝酸存在量較大時(shí)加入鹽酸，會(huì)影響鹽酸對(duì)硒的還原效果，進(jìn)而影響硒氫化物形成而使結(jié)果偏低。

3.2.1.3 鐵氰化鉀的影響

試驗(yàn)分別考察了加入鐵氰化鉀和不加入鐵氰化鉀對(duì)結(jié)果的影響。結(jié)果表明，鐵氰化鉀的加入對(duì)熒光響應(yīng)值無(wú)明顯影響，加入鐵氰化鉀和不加入鐵氰化鉀的標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光讀數(shù)值基本一致；加入鐵氰化鉀的樣品溶液讀數(shù)更加穩(wěn)定，多次讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差更低，樣品的平行性更好。因此加入鐵氰化鉀可以幫助穩(wěn)定原子熒光響應(yīng)值，使測(cè)定結(jié)果重復(fù)性更好。

3.2.1.4 還原劑濃度的影響

試驗(yàn)分別考察了10，15，20和25 g/L硼氫化鉀對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果見圖2。隨著硼氫化鉀濃度的提高，測(cè)定結(jié)果也隨之增高。分析原因：硼氫化鉀是硒形成氫化物的關(guān)鍵試劑。硼氫化鉀濃度偏低，會(huì)影響硒氫化物的生成效率，使結(jié)果偏低；隨著濃度的升高，硒被氫化得更完全，從而測(cè)定結(jié)果升高?？紤]結(jié)果的準(zhǔn)確性和試劑的消耗性，使用20 g/L硼氫化鉀為還原劑。

圖2 硼氫化鉀濃度對(duì)原子熒光光譜法測(cè)定結(jié)果的影響

3.2.2 電感耦合等離子體質(zhì)譜法的影響因素

3.2.2.1 質(zhì)量數(shù)選擇

硒有不同的同位素，其中豐度比最大的80Se（天然豐度比為49.8%）由于受氬的二聚物（Ar2，m/z 80）嚴(yán)重干擾，不能用于質(zhì)譜檢測(cè)。其他同位素有77Se（天然豐度比為7.6%）、78Se（天然豐度比為23.7%）、82Se（天然豐度比為9.2%），但這幾個(gè)同位素也受到40Ar37Cl、40Ca37Cl、39K38Ar、42Ca40Ar、81BH等多原子離子的干擾，綜合比較質(zhì)譜干擾因素和響應(yīng)值等方面的影響，選擇78Se為檢測(cè)質(zhì)量數(shù)。

3.2.2.2 質(zhì)譜檢條件的影響

試驗(yàn)比較了0.5，1.0和2.0 L/min的碰撞氣對(duì)測(cè)定效果的影響。由于硒受多原子離子的干擾比較嚴(yán)重，所以不能用標(biāo)準(zhǔn)模式進(jìn)行檢測(cè)，要采用氦氣碰撞模式在一定程度上消除干擾。由于選擇的質(zhì)量數(shù)是豐度比較小質(zhì)量數(shù)，其質(zhì)譜響應(yīng)較低，如果選擇過(guò)大流量的碰撞氣，則會(huì)使靈敏度過(guò)低，導(dǎo)致穩(wěn)定性、重現(xiàn)性變差，而碰撞氣流量過(guò)小、消除干擾能力弱，又會(huì)使結(jié)果偏大失真。綜合考慮靈敏度和穩(wěn)定性等方面的影響，選擇1.0 L/min作為碰撞氣流量。

3.2.2.3 消解條件的影響

圖3 微波消解條件對(duì)電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定結(jié)果的影響

分別考察了185 ℃/15min，190 ℃/20 min，195℃/25 min，200 ℃/15 min和200 ℃/25 min五種不同消解條件對(duì)結(jié)果的影響，結(jié)果見圖3。隨著消解條件的增強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果稍有降低。分析原因：等離子體質(zhì)譜測(cè)定時(shí)會(huì)受碳鏈增益效應(yīng)的影響，當(dāng)消解條件較弱時(shí)，樣品溶液中碳鏈消除不徹底，會(huì)在一定程度上對(duì)信號(hào)產(chǎn)生增益，而使測(cè)定結(jié)果偏高。

3.2.3 兩種測(cè)定方法的差異

由結(jié)果可看出，電耦合等離子體質(zhì)譜法的測(cè)定結(jié)果較原子熒光光譜法的測(cè)定結(jié)果高10%左右。分析原因：（1）電感耦合等離子體質(zhì)譜法的質(zhì)譜干擾和碳鏈增益效應(yīng)，由于硒的幾個(gè)同位素質(zhì)量數(shù)受氬氣的干擾很大，氬氣又是質(zhì)譜檢測(cè)的主要?dú)怏w，其多原子離子干擾只能通過(guò)碰撞模式在一定程度上減弱，而達(dá)不到徹底消除的效果；再則，乳粉中的有機(jī)物含量很大，在消解過(guò)程中如果不能將碳鏈完全消除，會(huì)對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)產(chǎn)生一定的碳鏈增益干擾，這種碳干擾已在近年的質(zhì)譜研究中被多次報(bào)道[11-14]，同時(shí)也由于選擇的不是主豐度比的質(zhì)量數(shù)，其信號(hào)值偏低，這種增益效應(yīng)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的影響就相對(duì)更加明顯；（2）原子熒光光譜法受硒的還原反應(yīng)和氫化反應(yīng)的影響，而這些反應(yīng)在一定程度上受硝酸的氧化效應(yīng)和氫氣的氫化效率的制約，同時(shí)配方乳粉中硒形態(tài)除了外源添加的硒（一般為亞硒酸鈉）外，還有硒蛋白、硒氨基酸等復(fù)雜生物形態(tài)[15]，這些硒如在前處理過(guò)程中不能完全被釋放出來(lái)，則會(huì)影響其形成氫化物，從而在一定程度上使結(jié)果偏低。

電耦合等離子體質(zhì)譜法的優(yōu)點(diǎn)在于樣品消化后，可以直接進(jìn)行上機(jī)操作，不需要進(jìn)行其他反應(yīng)處理，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)速度快；但缺點(diǎn)在于硒的幾個(gè)同位素質(zhì)量數(shù)都不同程度地受到氬的二聚物及多原子離子干擾，使檢測(cè)結(jié)果偏高，同時(shí)由于乳粉中的有機(jī)物含量較大而產(chǎn)生的碳增益效應(yīng)，也對(duì)結(jié)果產(chǎn)生正干擾。

原子熒光光譜法的優(yōu)點(diǎn)在于其檢測(cè)原理是利用硒的熒光響應(yīng)值作為檢測(cè)信號(hào)，檢測(cè)的特異性強(qiáng)，干擾較少；而缺點(diǎn)在于樣品在消化之后要進(jìn)行多步還原和氫化反應(yīng)，操作較為繁瑣，同時(shí)樣品中硒的形態(tài)釋放程度和還原反應(yīng)效率等因素，都會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響。

4 結(jié)論

試驗(yàn)分別用原子熒光光譜法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法對(duì)特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉中硒進(jìn)行測(cè)定，考察了微波消解條件、還原反應(yīng)條件、氫化反應(yīng)條件、質(zhì)譜條件等因素對(duì)結(jié)果的影響，比較了兩種檢測(cè)方法的差異。結(jié)果表明，電耦合等離子體質(zhì)譜法的測(cè)定結(jié)果普遍高于原子熒光光譜法的測(cè)定結(jié)果，其質(zhì)譜影響因素主要在于質(zhì)譜多原子離子干擾和碳增益效應(yīng)，而原子熒光光譜法主要受硒的形態(tài)釋放程度和還原反應(yīng)效率制約。