超聲微波協(xié)同酶法提取黃精多糖與抗氧化特性分析

巫永華，劉恩岐，張建萍*，陳尚龍，陳安徽，邵穎

徐州工程學(xué)院江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室（徐州 221111）

黃精（Polygonatum sibiricum）為百合科草本類植物[1]，中醫(yī)研究表明，其具有益氣、補(bǔ)腎、益脾、滋陰、潤(rùn)肺等功效，2 000多年前就被作為藥物，用以治療咳嗽、肺部疾病等[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃精含有大量多糖、一定量多酚類[3-4]、皂苷類[5]和氨基酸等[6]活性成分，研究表明，這些活性物質(zhì)是黃精具有抗病毒、抗疲勞、降血糖、降血脂、延緩衰老、提高免疫力、改善記憶力和較好的抗氧化能力[7-9]的物質(zhì)基礎(chǔ)。生黃精經(jīng)炮制后做成制黃精后不僅可以去除麻味，而且藥效得以增強(qiáng)。目前，關(guān)于黃精多糖的研究已有大量報(bào)道，陳鋼等[10]利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了黃精多糖的提取工藝，結(jié)果顯示在料液比1︰21.5（g/mL）、溫度73.5 ℃下提取2.5 h，黃精多糖的提取率可達(dá)12.25%。傅圣斌等[11]采用水溶劑煎煮提取黃精多糖，獲得9.2%的提取率，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)黃精多糖可明顯改善環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠的免疫功能。何連軍等[12]研究多花黃精多糖的單糖組成，表明多花黃精多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖組成。徐世忱等[13]分析黃精炮制前后粗多糖的提取率與總糖含量，結(jié)果表明生黃精與制黃精中粗多糖的提取率分別為13.0%和6.3%，說(shuō)明炮制會(huì)對(duì)多糖有降解作用。陳艷等[14]研究閃式提取法提取黃精多糖，并探討其對(duì)乳酸菌發(fā)酵特性的影響，結(jié)果表明該方法能快速高效制備黃精多糖，所制備的黃精多糖能加快乳酸菌發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸速率、促進(jìn)乳酸生長(zhǎng)的增殖作用，具有一定的益生元特性。

試驗(yàn)研究超聲-微波協(xié)同酶法提取黃精多糖的工藝，采用乙醇分級(jí)醇沉獲得不同的生黃精和制黃精多糖的多糖組分，對(duì)其得率和基本成分進(jìn)行分析，并測(cè)定DPPH·和O2-·清除能力以初步評(píng)價(jià)其體外抗氧化能力，以期為制備高抗氧化活性的黃精多糖組分提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃精（安徽亳州千草藥業(yè)有限公司）；纖維素酶（上海源葉生物科技有限公司）；DPPH（Sigma公司）；H2O2（Aladdin公司）；鄰苯三酚（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CW-2000超聲-微波協(xié)同萃取儀（上海新拓分析儀器科技有限公司）；R 206旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；真空冷凍干燥機(jī)（CHRIST公司）；TU-1810紫外分光光度計(jì)（北京普析通用有限公司）；L 550離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 黃精的預(yù)處理

用粉碎機(jī)將生黃精和制黃精粉碎，過(guò)80目篩，用塑料自封袋保存，置于干燥器中，備用。

1.3.2 超聲微波協(xié)同酶法提取黃精多糖工藝

試驗(yàn)從果膠酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶中篩選出最佳的酶，在此基礎(chǔ)上，采用單因素試驗(yàn)探討料液比、酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響，采用正交試驗(yàn)確定最佳的黃精多糖提取工藝。

1.3.3 黃精多糖的制備、去蛋白與分級(jí)醇沉

分別取適量的生黃精和制黃精，按試驗(yàn)所得最優(yōu)條件提取黃精多糖，采用Sevage法除蛋白3次，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以除去殘余的氯仿和正丁醇，加入一定純水復(fù)溶后，離心取上清液，加入無(wú)水乙醇至終醇濃度40%，攪拌均勻后于冰箱中過(guò)夜，以4 000 r/min離心10 min，得到40%醇沉多糖，收集上清液，并加入無(wú)水乙醇至終醇濃度60%，同上述操作，獲得60%和80%的醇沉多糖。各組分經(jīng)乙醚和丙酮洗滌后，冷凍干燥，稱重，置于-20 ℃冰箱中保存待用。40%，60%和80%乙醇沉淀的生黃精和制黃精多糖分別命名為PPs-40，PPs-60，PPs-80和PPPs-40，PPPs-60，PPPs-80。

1.3.4 多糖含量的測(cè)定

多糖的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[15]測(cè)定。以D-葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程y=8.925x-0.005 9，R2=0.997 4，并在此基礎(chǔ)上計(jì)算多糖含量和提取率。

1.3.5 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍(lán)法[16]進(jìn)行測(cè)定。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程y=0.007 38х+0.073 5，R2=0.994 6。

1.3.6 多酚含量的測(cè)定

測(cè)定采用福林酚法[17]。以沒(méi)食子酸作為校正品。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程y=0.016 03х-0.030 3，R2=0.999 5。

1.3.7 黃精多糖體外抗氧化活性的測(cè)定

1.3.7.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

測(cè)定DPPH自由基的清除能力能較為快速地評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物的抗氧化特性。參照唐仕榮等[18]的方法，稍作修改。試驗(yàn)用純凈水將各黃精多糖組分配成一定濃度的溶液，備用，用無(wú)水乙醇配制成質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL的DPPH·溶液。分別取4 mL不同濃度的多糖溶液，各加入2 mL DPPH·溶液，混合均勻，室溫暗處反應(yīng)30 min后以4 000 r/min離心10 min。上清液于517 nm處測(cè)吸光度。并以蒸餾水代替待測(cè)液作空白試驗(yàn)。樣品對(duì)DPPH自由基的清除率用式（1）計(jì)算。

式中：A0為4 mL蒸餾水和2 mL DPPH的吸光度；A1為4 mL樣品溶液和2 mL DPPH的吸光度；A2為4 mL樣品溶液和2 mL蒸餾水的吸光度。

1.3.7.2 超氧自由基清除率的測(cè)定

參照龔霞等[19]報(bào)道的方法測(cè)定。將各黃精多糖組分用蒸餾水配成一定濃度的溶液備用。取1 mL質(zhì)量溶度0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.2），于25 ℃水浴中保溫20 min，后分別加入1 mL不同濃度的樣品溶液和1 mL 25 mmol/L的鄰苯三酚溶液，振蕩搖勻后在25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，加入1 mL 2% HCl快速混勻以終止反應(yīng)，于325 nm處測(cè)定吸光度（Ax），空白對(duì)照組以相同體積蒸餾水代替樣品。按式（2）計(jì)算·清除率。

式中：A0表示空白對(duì)照吸光度；Ax表示樣品溶液吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次以上，并采用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、繪制曲線。半數(shù)抑制率（IC50）定義為清除自由基達(dá)50%時(shí)的樣品濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃精多糖超聲微波協(xié)同酶法提取工藝條件的確定

2.1.1 酶種類的確定

以生黃精為原料，為篩選最佳的作用酶，試驗(yàn)在料液比1︰20（g/mL）下分別添加0.5%果膠酶、纖維素酶和木瓜蛋白酶，置于超聲微波協(xié)調(diào)萃取儀中，在55 ℃處理10 min后，離心，測(cè)定上清液中多糖含量，計(jì)算多糖提取率。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

較沒(méi)有加酶的CK組，加入果膠酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶能一定程度提高黃精多糖的提取率，其中，加入纖維素酶的多糖提取率比CK組提高80.13%，具有極顯著差異；較添加木瓜蛋白酶和果膠酶組提高57.70%和30.03%。原因可能是黃精中含有較多的植物纖維，其自身就是一種多糖類，加入纖維素酶將其分解，從而提高多糖提取率。故選用纖維素酶做后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 不同酶處理對(duì)黃精多糖提取率的影響

2.1.2 料液比對(duì)黃精多酚提取效果的影響

選擇纖維素酶為作用酶，在添加量0.5%、pH 5.5、酶解溫度55 ℃和處理10 min條件下，考察不同料液比對(duì)黃精多糖提取率的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

隨著料液比的提高，黃精多糖提取率逐漸升高，當(dāng)料液比為1︰20（g/mL）時(shí)提取率最高，之后提取率基本不變。原因可能是料液比過(guò)高會(huì)導(dǎo)致樣品溶液被稀釋，減少了樣品與酶的接觸，從而影響提取率，導(dǎo)致相同時(shí)間內(nèi)的提取率降低。故后續(xù)試驗(yàn)中采用料液比1︰20（g/mL）左右做進(jìn)一步優(yōu)化。

圖2 料液比對(duì)黃精多糖提取率的影響

2.1.3 酶添加量的確定

在料液比1︰20（g/mL）、pH 5.5、酶解溫度55℃和處理10 min條件下，考察不同纖維素酶添加量對(duì)黃精多糖提取率的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

酶添加量的多少會(huì)直接影響底物與酶的接觸機(jī)會(huì)，影響提取效果。由圖3可知，當(dāng)纖維素酶添加量由0.25%提高到0.75%時(shí)，黃精多糖提取率逐漸升高；0.75%的纖維素酶添加量達(dá)到最優(yōu)，之后提取率反而下降。原因可能是過(guò)量的酶會(huì)降解一部分多糖，從而導(dǎo)致多糖提取率下降。因此，后續(xù)試驗(yàn)中采用纖維素酶添加量0.75%左右做進(jìn)一步優(yōu)化。

圖3 酶添加量對(duì)黃精多糖提取率的影響

2.1.4 酶解溫度的確定

在料液比1︰20（g/mL）、pH 5.5，酶添加量0.75%和處理時(shí)間10 min條件下，考察不同酶解溫度對(duì)黃精多糖提取率的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

由于超聲微波萃取儀最低只能設(shè)置50 ℃，試驗(yàn)考察50～70 ℃條件下的酶解效果。由圖4可知，在60℃之前，黃精多糖的提取率隨著溫度的提高而逐漸升高，在60 ℃時(shí)，提取率最高，隨后提取率下降，特別是到70 ℃時(shí)，提取率較最優(yōu)時(shí)下降29.83%。這與文獻(xiàn)報(bào)道的纖維素酶的最優(yōu)溫度在60 ℃左右一致。故后續(xù)正交試驗(yàn)中采用酶解溫度60 ℃左右做進(jìn)一步試驗(yàn)。

圖4 提取溫度對(duì)黃精多糖提取率的影響

2.1.5 酶解時(shí)間的確定

在料液比1︰20（g/mL）、pH 5.5、酶添加量0.75%和酶解溫度60 ℃條件下，考察不同酶解時(shí)間對(duì)黃精多糖提取率的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，提取時(shí)間對(duì)黃精多糖的提取率影響明顯，提取時(shí)間從10 min到20 min時(shí)，提取率由13.98%增加到16.78%，提高20.03%。之后，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率開(kāi)始下降。這可能是超聲-微波協(xié)調(diào)纖維素酶法能在20 min左右就將黃精中的糖類提出，而時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，超聲波能將部分多糖進(jìn)一步水解，從而影響提取率。故后續(xù)正交試驗(yàn)中采用20 min左右做進(jìn)一步試驗(yàn)。

圖5 提取時(shí)間對(duì)黃精多糖提取率的影響

2.1.6 超聲微波協(xié)同纖維素酶提取黃精多糖正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇以纖維素酶為作用酶，采用L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)料液比、酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，以確定超聲微波協(xié)同纖維素酶提取黃精多糖的最佳工藝條件。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1所示。

由表1中的R值可知，在試驗(yàn)所選的4個(gè)因素中，對(duì)黃精多糖提取效果的影響大小順序?yàn)椋篋（酶解時(shí)間）＞A（料液比）＞B（纖維素酶添加量）＞C（酶解溫度）；結(jié)合表2方差分析可知，酶解時(shí)間和料液比對(duì)超聲微波協(xié)調(diào)纖維素酶提取黃精多糖的提取效果具有顯著的影響（p＜0.05）。綜合得出，試驗(yàn)的最優(yōu)組合為A3B3C2D2，即料液比1︰23（g/mL）、纖維素酶添加量0.85%、酶解溫度60 ℃、酶解時(shí)間20 min。取3份一定量黃精粉，在最佳條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，得出黃精多糖提取率為17.53%，高于正交表中的各個(gè)組合，所以得出該條件為超聲微波纖維素酶協(xié)同提取黃精多糖的最佳工藝條件。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 方差分析結(jié)果

2.2 黃精多糖各組分得率及多糖、蛋白質(zhì)和多酚含量分析

乙醇分級(jí)沉淀多糖是根據(jù)多糖的分子量大小和多糖所含的羥基等基團(tuán)所表現(xiàn)出的極性大小來(lái)分離的，分子量大的和極性強(qiáng)的多糖會(huì)在較低溶度的乙醇中沉淀。由表3可知，在相同提取條件下，生黃精中60%和80%醇沉的多糖得率極顯著高于40%的醇沉多糖；制黃精中80%醇沉的多糖得率極顯著高于40%和60%的醇沉多糖，生黃精和制黃精多糖的不同分布可能與制黃精在炮制過(guò)程中發(fā)生的美拉德反應(yīng)、多糖降解等反應(yīng)有關(guān)。生黃精各組分的多糖含量較高，而制黃精多糖中多糖含量都沒(méi)有超過(guò)80%，說(shuō)明各制黃精各醇沉組分中還含有較多的非糖類成分，需要進(jìn)一步純化。另外，各自組分中蛋白質(zhì)和多酚含量極少，說(shuō)明蛋白質(zhì)去除較為徹底。

表3 黃精多糖各組分得率及組分分析結(jié)果

2.3 黃精多糖的抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果

DPPH·在乙醇溶液中呈紫色，且較為穩(wěn)定，但體系中存在抗氧化劑時(shí)，DPPH·的孤電子會(huì)被配成對(duì)，顏色變淺，在517 nm處吸光度變小，且其吸光度大小與配對(duì)電子數(shù)成化學(xué)計(jì)量關(guān)系，可以方便快速地評(píng)價(jià)抗氧化物的自由基清除能力。鄰苯三酚在堿性條件下會(huì)發(fā)生自氧化，生成O2-·，而抗氧化劑能夠終止鏈反應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)有色中間體產(chǎn)生的多少可以反映出抗氧化劑對(duì)O2-·的清除能力。試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定黃精多糖各組分對(duì)DPPH·和O2-·的清除能力來(lái)評(píng)價(jià)其抗氧化特性。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6、圖7和表4。

由圖6和圖7可以看出，黃精多糖各組分均具有一定的DPPH·和O2-·的清除能力，其清除效果與多糖的濃度呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。由表4可以看出，PPs-40對(duì)DPPH·的清除能力顯著高于其他組分；PPPs-40對(duì)O2-·的清除能力顯著高于其他組分。說(shuō)明分子量較大的、極性較強(qiáng)的多糖組分具有較好的抗氧化活性。另外，對(duì)于DPPH·的清除率而言，生黃精獲得的各多糖組分總體上優(yōu)于制黃精的，而對(duì)于O2-·的清除率而言，制黃精獲得的各多糖組分總體上優(yōu)于生黃精，2個(gè)指標(biāo)表現(xiàn)出的差異可能與2種體系下的起抗氧化作用的主要活性物質(zhì)有關(guān)，前者含有較多多糖，而后者在炮制加工中，多糖降解，但新產(chǎn)生5-羥甲基麥芽酚和5-羥甲基糠醛等抗氧化物質(zhì)[20]。

圖6 黃精多糖各組分對(duì)DPPH·的清除效果

圖7 黃精多糖各組分對(duì)O2-·的清除效果

表4 黃精多糖各組分抗氧化特性分析結(jié)果IC50 mg/mL

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)探討超聲微波協(xié)同酶法提取黃精多糖的工藝條件，結(jié)果表明，以生黃精為原料時(shí)，在以纖維素酶為作用酶，料液比1︰23（g/mL），酶添加量0.85%，溫度60 ℃下酶解20 min，黃精多糖的提取率為17.53%。經(jīng)用乙醇分級(jí)沉淀該條件下制備生黃精，獲得多糖組分PPs-40，PPs-60和PPs-80，其得率分別為5.61%，46.11%和48.28%，多糖含量分別為79.66%，88.92%和99.28%；制備得到的制黃精多糖，獲得多糖組分PPPs-40，PPPs-60和PPPs-80，其得率分別為21.08%，21.08%和57.84%，多糖含量分別為57.94%，70.18%和75.24%，生黃精和制黃精多糖幾乎不含蛋白質(zhì)和多酚。以DPPH·和O2-·清除率來(lái)評(píng)價(jià)各多糖組分的抗氧化特性，結(jié)果表明各組分均具有較好的抗氧化活性，且劑量-效果關(guān)系明顯，其中PPs-40具有最優(yōu)DPPH·清除能力，其IC50值為0.59 mg/mL；PPPs-40對(duì)O2-·具有最強(qiáng)的清除能力，其IC50值為0.64 mg/mL。不同指標(biāo)下的最強(qiáng)抗氧化組分不一致，可能與不同的抗氧化體系有關(guān)，后續(xù)可以對(duì)PPs-40和PPPs-40這2個(gè)組分進(jìn)行純化和結(jié)構(gòu)解析，以制備出具有較強(qiáng)抗氧化活性的單一多糖組分。