HPLC-ELSD法測(cè)定食品中五種糖的含量

張玲，薛滿*，李曉芹，張超，張雪婧，張芬

蘇州市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心（蘇州 215000）

糖的含量對(duì)食品的品質(zhì)有極為重要的影響，因此準(zhǔn)確測(cè)定糖的具體組成及含量對(duì)食品加工特性及研究食品的風(fēng)味特性有極為重要的作用[1]。目前針對(duì)食品中糖的測(cè)定方法大體有化學(xué)法、色譜法[2]。GB 5009.8—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測(cè)定》[3]中指出測(cè)定食品中糖的兩種方法，包括蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法和視差折光檢測(cè)器法，其中，視差折光檢測(cè)器在使用前需平衡時(shí)間較長(zhǎng)，近2 h，且受外部環(huán)境干擾嚴(yán)重，靈敏度較蒸發(fā)光散射檢測(cè)器方法低1～3個(gè)數(shù)量級(jí)，不能用于梯度洗脫系統(tǒng)。另外，通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)國(guó)標(biāo)方法所采用的流動(dòng)相條件即乙腈和水，不能使五種組分較好分離，所得峰形也不是很好，且分離時(shí)間長(zhǎng)達(dá)30 min。此次試驗(yàn)的目的就是建立既準(zhǔn)確靈敏又省時(shí)的測(cè)定食品中果糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖的HPLC-ELSD的檢測(cè)方法，優(yōu)化得到的HPLC-ELSD方法真正做到了提高了檢測(cè)靈敏度和重復(fù)性。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

乳粉、蜂蜜、某品牌茉莉清茶，市售。

果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖標(biāo)準(zhǔn)品，純度均大于99%，Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈、丙酮均為色譜純；氨水為分析純；水為超純水。

1.2 設(shè)備與設(shè)備

Waters 2695高效液相色譜儀，廠家沃特世科技（上海）有限公司；ELSD檢測(cè)器，廠家沃特世科技（上海）有限公司；電子天平，廠家梅特勒。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

分別稱取經(jīng)96±2 ℃干燥2 h的果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖各1 g，加水定容至50 mL，按試驗(yàn)需求配制成使用液。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：酰氨柱4.6 mm×250 mm，5 μ m；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：乙腈+丙酮（0.2%氨水）︰水（0.2%氨水）=75︰25（體積比）；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

檢測(cè)器條件：蒸發(fā)光檢測(cè)器；空氣作載氣，氣體壓力40 psi；漂移管溫度80 ℃；增益100；噴霧器冷卻狀態(tài)。

1.3.3 樣品制備

蜂蜜：準(zhǔn)確稱取1～2 g混勻后的樣品，加水定容至50 mL，搖勻，用干濾紙過(guò)濾，棄去初濾液，后續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜至樣品瓶，供液相色譜分析。

奶粉：準(zhǔn)確稱取5～10 g試樣于100 mL具塞離心管中，加入50 mL石油醚，混勻，放氣，振搖2 min，于1 800 r/min離心15 min，去除石油醚后重復(fù)以上步驟至去除大部分脂肪。蒸發(fā)殘留的石油醚，用玻璃棒將樣品搗碎并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用50 mL水分兩次沖洗離心管，洗液并入100 mL容量瓶中，緩慢加入乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液各5 mL，用水定容至刻度，磁力攪拌或超聲30 min，用干燥濾紙過(guò)濾，棄去初濾液，后續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾或離心獲取上清液過(guò)0.45 μ m微孔濾膜至樣品瓶，供液相色譜分析。

飲料：吸取50.0 mL移入100 mL容量瓶中，緩慢加入乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液各5 mL，用水定容至刻度，搖勻，靜置30 min，用干燥濾紙過(guò)濾，棄去初濾液，后續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾或離心獲取上清液過(guò)0.45 μ m微孔濾膜至樣品瓶，供液相色譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

當(dāng)使用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定食品中果糖等五種糖時(shí)，GB 5009.8—2016[3]采用的流動(dòng)相條件是乙腈（70%）和水（30%），但通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)選擇此配比流動(dòng)相測(cè)得的出峰時(shí)間較晚，即五種糖全部出峰近30 min。通過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)條件，將有機(jī)相換成乙腈和丙酮（1︰1）并添加0.2%氨水，將水相添加0.2%氨水，能夠得到較好的試驗(yàn)結(jié)果，這是因?yàn)楸軌蚴股V柱處于較為合適的極性，氨水能夠調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH，并能抑制糖類水解，使得峰形更好。在此條件下果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖既有很好的分離，又能將時(shí)間較國(guó)標(biāo)方法縮短近70%，即全部出峰時(shí)間僅10 min左右，優(yōu)化后的色譜圖見圖1。

2.2 ESLD條件的選擇

對(duì)于蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，要想得到較好的基線穩(wěn)定的色譜圖，選擇好漂移管溫度和載氣流速是很有必要的，漂移管溫度對(duì)檢測(cè)器的響應(yīng)有直接影響，適宜的溫度能夠使其達(dá)到較高的信噪比又不至于由溫度過(guò)高而引起的組分部分汽化而導(dǎo)致響應(yīng)值變小的情況。GB 5009.8—2016對(duì)檢測(cè)器的條件沒有做明確具體規(guī)定，試驗(yàn)經(jīng)過(guò)優(yōu)化蒸發(fā)光散射檢測(cè)器條件后得出，漂移管溫度為80 ℃，氣體壓力為40 psi，增益為100，噴霧器冷卻狀態(tài)，此時(shí)噪聲信號(hào)較小，同時(shí)色譜圖的基線平穩(wěn)，更適用于測(cè)低濃度目標(biāo)組分。

2.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

選用某品牌茉莉清茶作待測(cè)樣品進(jìn)行三水平加標(biāo)試驗(yàn)，每個(gè)水平取6份，并加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按飲料方法進(jìn)行前處理，測(cè)定條件一致并進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，外標(biāo)法定量計(jì)算回收率，五種糖的回收率均較為理想，方法可靠。標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果匯總于表1，圖譜見圖1，三水平加標(biāo)回收率、加標(biāo)量及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)據(jù)匯總于表2～表6，圖譜見圖2～圖5。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及R2值

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線重疊色譜圖

表2 某品牌茉莉清茶中果糖加標(biāo)回收率及精密度（n=6）

表3 某品牌茉莉清茶中葡萄糖加標(biāo)回收率及精密度（n=6）

表4 某品牌茉莉清茶中蔗糖加標(biāo)回收率及精密度（n=6）

表5 某品牌茉莉清茶中麥芽糖加標(biāo)回收率及精密度（n=6）

表6 某品牌茉莉清茶中乳糖加標(biāo)回收率及精密度（n=6）

圖2 某品牌茉莉清茶中所含糖的色譜圖

圖3 某品牌茉莉清茶1水平加標(biāo)回收6平行重疊色譜圖

圖4 某品牌茉莉清茶2水平加標(biāo)回收6平行重疊色譜圖

圖5 某品牌茉莉清茶3水平加標(biāo)回收6平行重疊色譜圖

2.4 樣品應(yīng)用

蜂蜜樣品、可樂樣品和乳粉樣品前處理按1.3.3操作，并上機(jī)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表7，圖譜見圖6～圖8。

表7 樣品測(cè)定結(jié)果 g/kg

圖6 蜂蜜中所含糖的色譜圖

圖7 奶粉中所含糖的色譜圖

圖8 可樂中所含糖的色譜圖

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)采用HPLC-ELSD法測(cè)定食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖五種糖，優(yōu)化并具體化了試驗(yàn)條件，使用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，漂移管溫度80 ℃，空氣作載氣，氣體壓力40 psi，色譜柱溫度40℃，進(jìn)樣體積10 μ L，流速1 mL/min，最終確定流動(dòng)相為乙腈+丙酮（0.2%氨水）︰水（0.2%氨水）=75︰25（體積比），其檢測(cè)速度快，試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性良好，線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，加標(biāo)回收率在94.7%～110.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）在0.3%～3.0%之間，分析結(jié)果可靠。