宣恩火腿粗肽液提取條件優(yōu)化

邱朝坤，范露，劉家祺

武漢設計工程學院食品與生物科技學院（武漢 430205）

近年來，隨著新興提取技術的不斷完善和科研技術的提升，對天然活性肽的研究日漸深入[1]。天然活性肽具有顯著的生理功能，如神經(jīng)調(diào)節(jié)、激素作用、免疫調(diào)節(jié)、抗血栓、抗高血壓、降膽固醇、抑菌、抗病毒、抗癌、抗氧化作用等，被譽為“21世紀人類健康的新寵兒”[2-3]。肽對食品滋味有重要作用[4]，各種肽呈味肽因肽鏈長度、氨基酸組成、氨基酸序列、空間結構的不同而呈現(xiàn)出不同的呈味特性[5]。肽還可與食品中其他風味物質(zhì)相互作用，明顯改變原有風味[6]。

宣恩火腿是中國湖北省恩施自治州一帶的特產(chǎn)，尤其以宣恩縣所產(chǎn)火腿最負盛名，在清代乾隆時期就作為貢品進貢朝廷。宣恩火腿具有肉質(zhì)細嫩、皮黃脂白肉紅、氣味鮮香宜人、滋味濃郁等特點[7]。火腿中的蛋白質(zhì)在內(nèi)源酶和外源酶的作用下分解成多肽、二肽等，而二肽的感官特性跟組成氨基酸有十分密切關聯(lián)，對其味感有重要作用[8]。試驗以宣恩火腿為研究對象，利用磷酸鹽提取火腿中的粗肽液，為后續(xù)研究宣恩火腿蛋白質(zhì)降解規(guī)律、多肽生理活性等提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

火腿（湖北省思樂牧業(yè)集團有限公司）。

所用試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

MS 104 S型分析天平（瑞士梅特勒）；LR-（5-10）型均質(zhì)機（無錫意凱自動化技術有限公司）；722型可見分光光度計（天津市普瑞斯儀器有限公司）；TDL-5 A型離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

剔除不可食用的火腿表面氧化層（約5 mm），油頭（指火腿最下方部分約3 cm）以及肥膘部分，取火腿塊約500 g，切碎，用絞肉機攪碎后攪拌均勻，裝入密封袋中備用，4 ℃存放

1.3.2 粗肽液提取

樣品多肽提取方法參照胡亞亞等[9]的方法進行，具體試驗步驟為：稱取25 g樣品于均質(zhì)機中，加入100 mL pH 7.0磷酸鹽緩沖液（4 ℃）勻漿2 min，勻漿液于4 ℃，以12 000 r/min離心20 min，取上清液加入3倍體積40%乙醇，4 ℃放置12 h后再次離心（4 ℃，12 000 r/min，20 min），所得上清液用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH 7.0，即得宣恩火腿粗肽液。

1.3.3 粗肽液測定

肽含量測定方法參照方細娟的方法進行[10]，具體試驗步驟為：準確吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL 2.5 mg/mL牛血清蛋白標準溶液于10 mL比色管中，用水補齊至1.0 mL，加入5.0 mL福林酚試劑，立即混勻，室溫下放置30 min，在650 nm處比色測定吸光度。以牛血清蛋白質(zhì)量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。取1 mL宣恩火腿粗肽液，按照標準曲線測定步驟測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算樣品多肽含量。

1.3.4 樣品質(zhì)量（g）與緩沖液體積（mL）比單因素試驗

控制乙醇體積分數(shù)為40%，勻漿液與乙醇體積比1︰3，緩沖液pH 7條件下，分別研究樣品質(zhì)量與緩沖液體積比為15︰100，20︰100，25︰100，30︰100和

35 ︰100 g/mL時，宣恩火腿中粗肽含量。

1.3.5 乙醇體積分數(shù)單因素試驗

控制樣品質(zhì)量與緩沖液體積比25︰100 g/mL，勻漿液與乙醇體積比1︰3，緩沖液pH 7條件下，分別研究乙醇體積分數(shù)20%，30%，40%，50%和60%時，宣恩火腿中粗肽含量。

1.3.6 緩沖液pH單因素試驗

控制乙醇體積分數(shù)40%，勻漿液與乙醇體積比1︰3，樣品質(zhì)量與緩沖液體積比25︰100 g/mL條件下，分別研究緩沖液pH為5，6，7，8和9時，宣恩火腿中粗肽含量。

1.3.7 勻漿液體積與乙醇體積比單因素試驗

控制乙醇體積分數(shù)40%，樣品質(zhì)量與緩沖液體積比為25︰100 g/mL，緩沖液pH 7條件下，分別研究勻漿液體積與乙醇體積比為1︰1，1︰2，1︰3，1︰4和1︰5時，宣恩火腿中粗肽含量。

1.3.8 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇樣品質(zhì)量與緩沖液體積比、緩沖液pH、乙醇體積分數(shù)、勻漿液與乙醇體積比4個因素，以宣恩火腿中粗肽含量為指標，設計4因素3水平正交試驗，對提取條件進行優(yōu)化。

2 結果與分析

2.1 樣品質(zhì)量與緩沖液體積比單因素試驗結果

宣恩火腿中的肽主要來源于蛋白質(zhì)的降解，大部分屬于水溶性或能用低濃度鹽溶液溶解，采用緩沖鹽提取火腿中的肽，緩沖液體積對提取效果具有重要影響，體積過少，肉基質(zhì)無法分散，肽提取不充分，體積過大，樣品均質(zhì)勻漿效果可能變差導致提取到的肽反而變少。從圖1可以看出，樣品中多肽含量隨著溶劑用量的增大呈先上升后下降趨勢，樣品質(zhì)量與緩沖液體積比20︰100 g/mL時提取到的多肽含量最高，為2.35 g/100 g，因而選取15︰100，20︰100和25︰100 g/mL這3個水平進行后續(xù)正交試驗。

2.2 乙醇體積分數(shù)單因素試驗結果

粗肽提取液仍然以蛋白質(zhì)為主體物質(zhì)，因此采用乙醇來沉淀蛋白并離心去除，故而選擇恰當?shù)囊掖俭w積分數(shù)顯得尤為重要，乙醇體積分數(shù)過低，達不到沉淀蛋白的效果，乙醇體積分數(shù)過高，蛋白質(zhì)和多肽溶解度都會下降。從圖2可以看出，隨著乙醇體積分數(shù)增加，提取的多肽含量逐漸下降，但乙醇體積分數(shù)20%時，多肽含量達2.94 g/100 g，明顯高于其他水平（包括高于其他單因素試驗里多肽含量），可能是蛋白質(zhì)沒有沉淀完全，而福林酚試劑也會與之反應，導致測定結果偏高。綜合考慮，選擇乙醇體積分數(shù)為30%，40%和50%進行后續(xù)正交試驗。

圖1 樣品質(zhì)量與緩沖液體積比對粗肽液提取效果的影響

圖2 乙醇體積分數(shù)對粗肽液提取效果的影響

2.3 緩沖液pH單因素試驗結果

由于受多肽骨架在中氨基酸側(cè)鏈的影響，多肽溶解性與提取液pH有較大關聯(lián)度，忽曉平等[11]對金華火腿多肽的提取研究結果表明，采用磷酸鹽緩沖液做提取劑時，強酸性環(huán)境、中性偏堿性環(huán)境有利于金華火腿中多肽的提取。磷酸鹽緩沖液的pH 2或pH 7.0～9.0時，提取率較高。從圖3可以看出，宣恩火腿多肽在中性偏堿條件下溶解度更高，因而選擇緩沖液pH 7.0，8.0和9.0進行后續(xù)正交試驗。

2.4 勻漿液體積與乙醇體積比單因素試驗結果

乙醇體積對提取效果的影響與乙醇體積分數(shù)相對應，從圖4可以看出，勻漿液與乙醇體積比1︰3時能夠提取到的多肽含量最大，綜合考慮，選擇勻漿液體積與乙醇體積比1︰1，1︰2和1︰3進行后續(xù)正交試驗。

圖3 緩沖液pH對粗肽液提取效果的影響

圖4 勻漿液體積與乙醇體積比對粗肽液提取效果的影響

2.5 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果進行四因素三水平正交試驗，試驗因素水平表見表1，正交試驗結果見表2。

表1 正交試驗設計表

表2 正交試驗結果

對正交試驗進行極差分析，得出宣恩火腿中粗肽液提取的最佳工藝條件為A1B2C1D3，即樣品質(zhì)量與緩沖液體積比15︰100 g/mL，乙醇體積分數(shù)40%，緩沖液pH 7.0，勻漿液與乙醇體積比1︰3。4個因素對宣恩火腿中粗肽液的提取效果影響性存在差別，其重要性依次為C＞B＞A＞D，即緩沖液pH＞乙醇體積分數(shù)＞樣品質(zhì)量與緩沖液體積比＞勻漿液體積與乙醇體積比，因此在對宣恩火腿中的粗肽液的提取時，應嚴格控制緩沖液pH以保證宣恩火腿中粗肽液較高的提取率。

由于A1B2C1D3在正交表中并未出現(xiàn)，正交表中最高組合為A3B2C1D3，因而在上述2組組合中進行驗證試驗，結果見表3。

由表3可知，2種條件下提取的粗肽含量差異不大，2種條件下差別僅在緩沖液用量，而在單因素試驗中當。樣品質(zhì)量與緩沖液體積比15︰100和25︰100 g/mL時提取的粗肽含量也比較接近，從節(jié)約試劑角度考慮，選取樣品質(zhì)量與緩沖液體積比15︰100 g/mL。

表3 驗證試驗

3 結論

以中國四大名腿之一的宣恩火腿為對象，研究其多肽的提取條件，通過單因素試驗和正交試驗對影響宣恩火腿中粗肽液提取效果的樣品質(zhì)量與緩沖液體積比、乙醇體積分數(shù)、緩沖液pH、勻漿液與乙醇體積比進行優(yōu)化，結果表明，宣恩火腿多肽最佳提取條件為：樣品質(zhì)量與緩沖液體積比15︰100 g/mL，乙醇體積分數(shù)40%，緩沖液pH 7.0，勻漿液與乙醇體積比1︰3。在此條件下能最大限度提取出宣恩火腿中的多肽，為后續(xù)研究宣恩火腿蛋白質(zhì)降解規(guī)律、多肽生理活性等提供參考。