辣木籽中酚酸化合物的提取工藝

湯遜尤，王李平，林晨，方麗，張方圓，李雪瑩

中國廣州分析測試中心，廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室（廣州 510070）

辣木原產(chǎn)于印度及非洲地區(qū)[1-2]，是一種耐旱且適應(yīng)性很強的速生植物[3-4]，因其根部具有辛辣味而得名辣木。自20世紀(jì)初中國由緬甸進(jìn)行引種以來，其種植面積已發(fā)展至長江以南的大部分省市[5-6]。辣木的各個部位均含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)而具有食用價值及藥用價值，因此被人們稱為“神奇之樹”[7]。自2012年衛(wèi)生部批準(zhǔn)將辣木葉劃分為新資源食品后，辣木在中國的關(guān)注度日益提升。目前辣木已被廣泛應(yīng)用于食品[8-9]、凈水[10]、醫(yī)藥[11]、工業(yè)原料[12]等領(lǐng)域，具有較大的商業(yè)和工業(yè)開發(fā)潛力。

酚酸類化合物在植物中分布十分廣泛，辣木籽中的酚酸化合物主要為沒食子酸及鞣花酸[13]。這兩種酚酸化合物具有抗心腦血管疾病、抗菌消炎、抗腫瘤、降血糖等藥理活性[14-15]。辣木籽中的營養(yǎng)均衡，因此成為辣木中各部位的研究重點。辣木籽中含有豐富的油脂、蛋白質(zhì)、多糖、黃酮類化合物、多酚類化合物、維生素、礦質(zhì)元素及可溶性纖維等多種營養(yǎng)成分，其中研究最多的是油脂和黃酮類化合物[16-17]。試驗就辣木籽中研究較少的酚酸類化合物進(jìn)行相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

辣木籽（購于廣州清平藥材市場）；乙醇、甲醇、乙酸乙酯、磷酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；乙腈（色譜純，Honeywell）；沒食子酸、鞣花酸（中國食品藥品檢定研究院）。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（Agilent 1290，美國安捷倫公司）；搖擺式中藥粉碎機（上海頂帥電氣公司）；Sartorius電子天平（BSA 224 S，廣州市深華實驗儀器設(shè)備有限公司）；超聲波清洗儀（KQ 2200 B，昆山市超聲儀器有限公司），循環(huán)水式多用真空泵（SHB-Ⅲ，鄭州長城科貿(mào)有限公司），電熱恒溫水浴鍋（WBK-4 B型，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；氮吹儀（EFAA-DC 12，上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 辣木籽中酚酸化合物的提取

精密稱取0.5 g粉碎后的辣木籽于離心管中，加入一定體積的甲醇溶液，置于超聲中進(jìn)行提取，設(shè)定超聲時間與溫度。待提取液冷卻后真空抽濾，將濾液過0.22 μm針孔過濾器，進(jìn)行HPLC分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱Phenomenon Gemini C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；流動相，A 0.1%磷酸水溶液，B乙腈；梯度：0 min，2% B；5 min，2% B；20 min，30% B；35 min，80% B；流速1 mL/min；檢測波長260 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

試驗選擇辣木籽中2種主要的酚酸化合物標(biāo)準(zhǔn)品作為參照，即沒食子酸、鞣花酸。分別精確稱取這2種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5.05和5.02 mg，用甲醇定容至25 mL。然后按照需要逐級稀釋，進(jìn)行HPLC分析。

1.3.4 單因素試驗設(shè)計

稱取0.5 g粉碎后的辣木籽，以沒食子酸、鞣花酸的提取量為指標(biāo)，研究提取時間（20，40，60，80和100 min）、提取溫度（40，50，60，70和80 ℃）、液料比（1︰10，1︰20，1︰30，1︰40和1︰50 g/mL）、藥材顆粒度（20，40，60，80和100目）對辣木籽中酚酸化合物提取量的影響。

1.3.5 因素水平設(shè)計

以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，對辣木籽中酚酸化合物提取量影響較大的3個因素，采用響應(yīng)面優(yōu)化法中的中心組合設(shè)計進(jìn)行優(yōu)化試驗。以液料比（A）、提取溫度（B）和提取時間（C）為自變量，沒食子酸、鞣花酸的提取量為響應(yīng)值進(jìn)行試驗設(shè)計，因素水平設(shè)計表如表1所示。

表1 響應(yīng)面分析因素水平

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系及檢出限

分別量取不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2小節(jié)的方法進(jìn)行HPLC分析，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如表2所示。

表2 2種酚酸的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、線性范圍及檢出限

2.2 單因素試驗

影響辣木籽中沒食子酸、鞣花酸提取量的主要因素為提取溶劑、提取時間、提取溫度、液料比和顆粒度，因此對各因素進(jìn)行考察。

2.2.1 不同提取溶劑對辣木籽中沒食子酸及鞣花酸提取量的影響

分別考察甲醇、乙醇、乙腈以及乙酸乙酯等不同溶劑對辣木籽中沒食子酸及鞣花酸提取量的影響，結(jié)果如圖1所示。

結(jié)果表明，不同極性的提取溶劑的提取量有所不同。根據(jù)化學(xué)中“相似相溶”的原理可知，這兩種酚酸化合物的極性與甲醇極性更為接近。因此這4種不同提取溶劑中甲醇對于2種酚酸的提取量最高。

2.2.2 提取時間及溫度對辣木籽中沒食子酸及鞣花酸提取量的影響

提取溫度對于提取量的影響較大，過高或過低都不利于酚酸化合物的提取。因此，選取的考察提取溫度范圍為40～80 ℃。同時，試驗所考察的提取時間范圍為20～100 min。這2個因素的影響規(guī)律如圖2所示。

隨著提取溫度的增加，溶液提取沒食子酸及鞣花酸的量逐漸增加，在所考察的提取溫度范圍里，60 ℃時的提取效果達(dá)到最佳。從圖2可知，提取時間對于2種酚酸化合物的提取量影響不大，提取時間60 min時，沒食子酸及鞣花酸的提取量達(dá)到最大。

圖2 提取溫度（a）和時間（b）對2種酚酸化合物提取量的影響

2.2.3 液料比及顆粒度對辣木籽中沒食子酸及鞣花酸提取量的影響

液料比及顆粒度的不同，對辣木籽中酚酸物質(zhì)的提取量也有所差異。試驗考察不同液料比及顆粒度對沒食子酸及鞣花酸提取量的影響，其結(jié)果如圖3所示。

不同液料比對辣木籽中酚酸化合物提取量的影響較大。其提取量隨液料比增大而逐漸增大，液料比1︰30（g/mL）時，提取完全，提取量趨于平衡。由3圖（b）可知，隨著顆粒度的增大，沒食子酸及鞣花酸的提取量逐漸增大，顆粒度80目時達(dá)到最大。隨后提取量則逐漸降低。這是由于適當(dāng)增大顆粒度能增大物料的比表面積，有利于有效物質(zhì)的提取。若顆粒度過小，其導(dǎo)致有效物質(zhì)被吸附，反而會影響其提取量，導(dǎo)致提取量降低，不利于萃取。

圖3 液料比（a）和顆粒度（b）對2種酚酸化合物提取量的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝條件

2.3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果及分析

根據(jù)表1中響應(yīng)面試驗方案，設(shè)計試驗及試驗結(jié)果見表3，回歸方程方差分析見表4。

表3 試驗方案及結(jié)果

表4 2種酚酸提取量的回歸方程方差分析

根據(jù)Design-Expert 7.0軟件的分析結(jié)果可知，該模型p值均小于0.000 1，表明模型擬合成功。對沒食子酸和鞣花酸的提取量采用二次多項式模型分別進(jìn)行擬合，其方程為：Y沒食子酸=0.11+1.750×10-3A+1.946×10-3B+3.029×10-3C-1.250×10-3AB+2.500×10-5AC+6.750×10-4BC-2.542×10-3A2-2.100×10-3B2-2.100×10-3C2（R2=0.934 6）；Y鞣花酸=0.13+1.898×10-3A+2.634×10-3B+4.361×10-3C-9.875×10-4AB+8.125×10-4AC+6.250×10-5BC-3.236×10-3A2-2.670×10-3B2-2.971×10-3C2（R2=0.950 1）。

擬合方程相關(guān)性R＞0.9，其擬合度良好，可用于辣木籽中沒食子酸和鞣花酸提取量的優(yōu)化。

2.3.2 響應(yīng)曲面分析

采用Design-Expert 7.0軟件對所得試驗進(jìn)行響應(yīng)曲面分析，得出兩兩因素之間對沒食子酸和鞣花酸提取量的影響。結(jié)果如圖4和圖5所示。

圖4和圖5中等高線圖中曲線呈橢圓形，說明提取時間、提取溫度及液料比兩兩之間辣木籽中酚酸的提取量的交互作用顯著。由響應(yīng)曲面的斜率的分析可知，辣木籽中沒食子酸和鞣花酸的提取量均隨著提取時間、提取溫度及液料比的增大而先升高后減小。兩者說明所選的3個優(yōu)化因素對于兩類酚酸化合物的提取量影響十分顯著。由兩兩因素之間的響應(yīng)曲面分析，以及對表4中各因素p值可知，各因素之間對辣木籽中沒食子酸和鞣花酸的提取量影響順序為：提取時間＞提取溫度＞液料比，Design-Expert 7.0軟件給出的最優(yōu)灰化條件為：提取時間75.8 min、提取溫度64.8℃、液料比1︰32.8（g/mL）；方程預(yù)測在該條件下沒食子酸提取量為0.108 3 mg/g、鞣花酸提取量0.130 8 mg/g。為方便實際操作，修正最優(yōu)條件為：提取時間76 min、提取溫度65 ℃、液料比1︰33（g/mL）。

2.3.3 最佳條件驗證

按2.3.2小節(jié)的最優(yōu)試驗條件，進(jìn)行6次平行驗證性試驗，其色譜圖如圖6所示。測得在最優(yōu)試驗條件下沒食子酸及鞣花酸的提取量的平均值分別為0.104 9和0.131 7 mg/g，與預(yù)測值接近，且RSD值為0.86%和1.07%，表明響應(yīng)面分析所得的理論最佳提取條件準(zhǔn)確可靠。

圖4 兩兩交互因素對辣木籽中沒食子酸提取量的影響

圖5 兩兩交互因素對辣木籽中鞣花酸提取量的影響

圖6 辣木籽樣品與酚酸對照品色譜圖

3 結(jié)論

根據(jù)所建立高效液相色譜法對辣木籽中沒食子酸和鞣花酸進(jìn)行測定，通過單因素試驗然后在此基礎(chǔ)上進(jìn)行中心組合設(shè)計-響應(yīng)面試驗考察提取時間、提取溫度和液料比等條件對2種酚酸化合物提取量的影響，并分析得到最佳提取條件：提取時間76 min、提取溫度65 ℃、液料比為1︰33（g/mL）。在此條件下，沒食子酸和鞣花酸的提取量達(dá)到最大值。方法簡單，而且響應(yīng)面優(yōu)化的提取量實際測定值與理論值無顯著差異。研究結(jié)果可為辣木籽中沒食子酸和鞣花酸的提取提供工藝指導(dǎo)。