帶魚蛋白水解肽制備條件優(yōu)化

王曉玲*，張芹，張洪芳，賀延蘢，韋素貞

1. 威海海洋職業(yè)學(xué)院食品工程系（榮成 264300）；2. 威海市水產(chǎn)學(xué)校（榮成 264300）

帶魚（Hairtail）是我國盛產(chǎn)的四大經(jīng)濟魚種之一，在我國的黃海、東海、渤海一直到南海都有分布。在帶魚加工過程中產(chǎn)生的下腳料占帶魚質(zhì)量的1/2以上[1-2]，這些下腳料中含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白資源，若隨意丟棄不僅浪費資源，還會污染環(huán)境，故有效利用帶魚下腳料便成為研究熱點。

試驗以帶魚下角料為原料，經(jīng)木瓜蛋白酶酶解得帶魚蛋白水解肽，利用單因素試驗及正交試驗優(yōu)化水解條件，為優(yōu)化帶魚蛋白水解肽-金屬配合物的制備條件做基礎(chǔ)研究，并為后期研究帶魚蛋白水解肽-金屬配合物脫除重金屬活性研究準備，以期建立一種高效、經(jīng)濟、環(huán)保脫出重金屬的方法[3-4]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

帶魚下腳料，購于浙江舟山興業(yè)公司，將帶魚經(jīng)碎肉粉碎機粉碎后，分裝成100 g/袋，于-18 ℃冰箱冷凍保存，使用前于4 ℃冰箱解凍24 h。

1 000 U/mg木瓜蛋白酶，上海金穗生物科技有限公司；溴酚藍，分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠；鹽酸（HCl）、氫氧化鈉（NaOH）、抗壞血酸、乙酸鈉及三氯甲烷（CHCl3），分析純（AR），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；試驗過程中所使用的水皆為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

BCD-190 NIM型冰箱，蘇州三星電子；PHS-3 C型pH計，上海晶磁儀器有限公司；HWS-12型電磁恒溫水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；85-2型恒溫磁力攪拌器，常州國華電器有限公司；HZ-8812 S型水浴恒溫振蕩器，太倉華利達儀器有限公司；CR 21 G型冷凍離心機，日本日立公司；BSA 323 S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；FSH-2型可調(diào)高速勻漿機，常州國華電器有限公司。

1.3 帶魚蛋白水解肽的制備

取20 g解凍好的帶魚下腳料，加入200 mL去離子水，勻漿后調(diào)節(jié)pH為6.5，在45 ℃下保溫10 min。按帶魚下腳料質(zhì)量加入適量的木瓜蛋白酶，在一定溫度下進行酶解，酶解過程中不斷攪拌，并且每隔2 h調(diào)節(jié)pH。酶解結(jié)束后，于90 ℃水浴滅酶10 min，混合液在4 ℃下以5 000 r/min離心20 min，除去上層油膜和下層沉淀即為帶魚蛋白水解肽。酶解條件由試驗探究優(yōu)化得出。

1.4 水解度的測定

水解度的測定方法有多種，常用的有茚三酮法、三氯乙酸法、甲醛滴定法等方法。茚三酮法比色時讀數(shù)不穩(wěn)定，三氯乙酸法酸溶蛋白中含有水解之前的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致這兩種方法結(jié)果偏差較大，故試驗采用甲醛滴定法。計算公式：DH=（h-h0）/htot。式中：h為帶魚蛋白酶解液中的—COOH或—NH基團的含量（mmol/g），h0為未經(jīng)木瓜蛋白酶水解的帶魚原料中的—COOH或—NH基團的含量（mmol/g），htot為每克帶魚蛋白的肽鍵毫摩爾數(shù)（mmol/g），經(jīng)測定分析，帶魚的htot=8.17 mmol/g[5-6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 加酶量對酶解效果的影響

木瓜蛋白酶占帶魚的質(zhì)量分數(shù)對酶解效果影響很大。一般說來，加酶量越大，酶解的效率越高，但加酶量過大不僅浪費，還會影響酶解效果，產(chǎn)生苦味氨基酸[7]。在料液比1∶10 g/mL、pH 6.5、酶解溫度50 ℃、酶解時間8 h條件下，木瓜蛋白酶添加量對酶解效果的影響，如圖1所示。當(dāng)木瓜蛋白酶添加量為0.012%～0.020%時，酶解度呈不斷增加趨勢，最高達到66.24%；當(dāng)超過0.020%時，增加趨勢不顯著（p＞0.05）。所以，木瓜蛋白酶添加量應(yīng)控制在0.020%，即當(dāng)添加量為20 000 U/g原料時，酶解效果最佳。

圖1 木瓜蛋白酶添加量對酶解度的影響

2.2 酶解溫度對酶解效果的影響

酶解溫度是決定酶催化活性重要參數(shù)之一，溫度過高或過低均會抑制酶活性甚至失活，從而導(dǎo)致酶解效果變差[8]。在料液比1∶10 g/mL、pH 6.5、木瓜蛋白酶添加量0.020%、酶解時間8 h的條件下，酶解溫度對酶解效果的影響，如圖2所示。當(dāng)溶液溫度低于45℃時，酶解度隨溫度升高而增加；當(dāng)溶液溫度為45 ℃時，酶解度最大，為69.68%；當(dāng)高于45 ℃時，酶解度隨溫度的升高而減少（p＜0.05）。故木瓜蛋白酶酶解帶魚下腳料的最佳溫度應(yīng)是45 ℃。

圖2 溫度對酶解度的影響

2.3 酶解pH對酶解效果的影響

酶解溶液pH也是決定酶催化活性重要參數(shù)之一，pH過高或過低均會抑制酶活性甚至失活，從而導(dǎo)致酶解效果變差[8]。在料液比1∶10 g/mL、酶解溫度45 ℃、木瓜蛋白酶添加量0.020%、酶解時間8 h條件下，酶解溶液pH對酶解效果的影響，如圖3所示。當(dāng)pH低于6.5時，酶解度隨pH升高而增加；當(dāng)溶液pH為6.5時，酶解度最大，為70.06%；當(dāng)pH高于6.5時，酶解度隨pH的升高而減少（p＜0.05）。故木瓜蛋白酶水解帶魚下腳料的最佳pH應(yīng)是6.5。

圖3 pH對酶解度的影響

2.4 酶解時間對酶解效果的影響

酶解時間對木瓜蛋白酶酶解的效果，與木瓜蛋白酶添加量對木瓜蛋白酶酶解的效果相似。一般說來，酶解時間越長，酶解得越徹底，但酶解時間過長會產(chǎn)生苦味氨基酸，且造成能源的嚴重浪費[9]。在料液比1∶10 g/mL、pH 6.5、酶解溫度45 ℃、木瓜蛋白酶添加量0.020%條件下，酶解時間對酶解效果的影響，如圖4所示。當(dāng)酶解時間為0～8 h時，酶解度隨酶解時間的延長呈不斷增加的趨勢，最高達到70.07%；繼續(xù)酶解，酶解度隨酶解時間的增加趨勢不顯著（p＞0.05）。所以，當(dāng)木瓜蛋白酶水解帶魚下腳料8 h時，酶解完全。

圖4 時間對酶解度的影響

2.5 正交試驗優(yōu)化酶解條件

根據(jù)前期單因素實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)水解時間、pH、溫度、加酶量等對水解度有不同的影響?，F(xiàn)以水解時間、pH、溫度、加酶量設(shè)計四因素三水平正交試驗（表1和表2），以確定木瓜蛋白酶水解帶魚蛋白的最佳水解條件。

以酶解時間、酶解pH、酶解溫度、木瓜蛋白酶活力為影響因素，設(shè)計四因素三水平正交試驗，其試驗結(jié)果見表2。由表2可知，影響水解度的因素依次為D＞B＞C＞A，即酶活力＞pH＞溫度＞時間。通過進一步方差分析，由表3可看出酶活力對水解度的影響最顯著，其次是pH、溫度和時間，它們對水解度的影響不顯著（p＞0.05）。通過正交試驗，獲得最佳酶解工藝組合，為A1B2C2D2，即時間6 h、pH 6.5、溫度45℃、加酶量20 000 U/g帶魚。通過驗證試驗，帶魚酶解液的水解度可達到71.3%。

表1 因素與水平

表2 L9(34)正交試驗結(jié)果

表3 方差分析表

3 結(jié)論

用木瓜蛋白酶對帶魚下腳料進行酶解，經(jīng)過單因素試驗優(yōu)化和正交試驗驗證，在料液比1︰10 g/mL、加酶量20 000 U/g帶魚、45 ℃、pH 6.5、酶解6 h條件下，帶魚蛋白水解度高達71.3%。該研究結(jié)果為后續(xù)帶魚蛋白水解肽-金屬配合物的制備條件做基礎(chǔ)研究，為提高帶魚下腳料的高值利用提供條件[10]。