微波輻射-蛋白酶耦合循環(huán)催化蛋白質(zhì)反應(yīng)器及工藝

左繼紅 ，劉麗麗，崔政偉

1. 湖南鐵道職業(yè)技術(shù)學(xué)院牽引學(xué)院（株洲 412001）；2. 江南大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院（無(wú)錫 214422）

大豆蛋白水解成多肽和氨基酸后作為保健品供體質(zhì)較弱人群食用，但是傳統(tǒng)的蛋白酶水解大豆蛋白所需時(shí)間不但比較長(zhǎng)而且蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率也比較低[1-2]。

微波輻射能直接加熱到酶的官能團(tuán)促進(jìn)酶解反應(yīng)，但我國(guó)對(duì)微波輻射-蛋白酶耦合催化反應(yīng)器研究比較少，現(xiàn)在的裝置主要是家用微波爐改裝而成；微波輻射致熱效應(yīng)會(huì)使反應(yīng)物局部發(fā)熱而導(dǎo)致蛋白酶失活（蛋白酶活性低于60 ℃）。工業(yè)微波輻射蛋白質(zhì)反應(yīng)器研究者更少，有必要對(duì)微波輻射-蛋白酶耦合循環(huán)催化大豆蛋白反應(yīng)器進(jìn)行研究[3-8]。

設(shè)計(jì)了一套微波輻射-蛋白酶耦合循環(huán)催化反應(yīng)器，并對(duì)反應(yīng)器酶解大豆蛋白最佳工藝條件研究，并用高效液相色譜法對(duì)常規(guī)酶解和微波酶解進(jìn)行分析比較，微波酶解能縮短酶解時(shí)間和提高蛋白質(zhì)水解率。

1 材料與方法

1.1 材料與主要設(shè)備

大豆蛋白粉（純蛋白70%）秦皇島金海食品工業(yè)有限公司；木瓜蛋白酶粉（酶活力100萬(wàn) U/g）無(wú)錫雪梅酶制劑廠(chǎng)；鹽酸溶液（0.01 mol/L）；NaOH溶液（0.05 mol/L）；甲醛溶液（36%～38%）；酚肽指示劑（含量0.5%，底物50%乙醇）；甲醇、乙腈（色譜純）；NaH2PO4·H2O（分析純）；硼酸緩沖液、鄰苯二甲醛、氯甲酸芴甲酯及17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合液；巰基乙醇、NaOH 和氯化亞錫（均為分析純），三氯乙酸，雙蒸水（二次蒸餾）。

格蘭仕CH 2082電磁爐（酶滅活用）、廣東格蘭仕集團(tuán)有限公司；堿式滴定管（加物料用），泰興市滬泰玻璃制品公司；溫控水浴鍋，杭州格圖科技有限公司；自動(dòng)分析天平，上海方瑞儀器有限公司。（以上設(shè)備均由江南大學(xué)過(guò)程裝備與制造中心實(shí)驗(yàn)室提供）；安捷倫液相色譜儀，配有真空脫氣機(jī)、雙元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱，美國(guó)Agilent公司；EBA 21型臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)Hettich公司（以上均由江南大學(xué)食品學(xué)院色譜工作站提供）。

1.2 微波輻射-蛋白酶耦合反應(yīng)器的設(shè)計(jì)

自制微波輻射-蛋白酶耦合反應(yīng)器（如圖1），反應(yīng)器關(guān)鍵改裝在于微波爐（圖2），在后面打孔，因?yàn)槲⒉ㄝ椛渖疃葹? cm。反應(yīng)器采用聚丙稀材料制造的螺旋形管道反應(yīng)器（圖3），螺旋形管道反應(yīng)器內(nèi)置與改裝在于微波爐內(nèi)（圖4）；反應(yīng)器采用夾套式換熱設(shè)計(jì)（圖5），外層與水浴加熱控制反應(yīng)溫度60℃以下。

圖1 微波輻射-蛋白酶耦合反應(yīng)器

圖2 微波爐改裝（開(kāi)孔）

圖3 螺旋形管道反應(yīng)器

圖4 微波發(fā)生器實(shí)物圖

圖5 夾套式換熱反應(yīng)器

1.3 微波輻射-蛋白酶耦合反應(yīng)器反應(yīng)條件的設(shè)置

微波輻射功率可調(diào)，微波輻射功率160～800 W有5個(gè)檔位；微波輻射時(shí)間可調(diào)，改裝的微波爐可以設(shè)定時(shí)間；反應(yīng)物的溫度可調(diào)，反應(yīng)器采用夾套式換熱設(shè)計(jì)外層的水浴溫度可以調(diào)整；物料的pH可以測(cè)定調(diào)整。

1.4 測(cè)定方法

氨基氮含量測(cè)定：采用甲醛滴定法[9-10]（氨基氮含量越高蛋白質(zhì)水解率越高）；游離氨基酸的含量測(cè)定：高效液相色譜法分析。

1.5 微波連續(xù)酶解反應(yīng)條件的設(shè)置

試驗(yàn)基于改裝的微波爐設(shè)計(jì)的微波輻射-蛋白酶耦合反應(yīng)器，主要考慮一下幾個(gè)條件：一、微波輻射的功率可以根據(jù)微波爐的功率調(diào)整；二、反應(yīng)物是去離子水與固態(tài)蛋白混合物濃度可以調(diào)整；三、微波輻射時(shí)間可以進(jìn)行人工控制；四、蛋白酶的用量可以調(diào)整；五、反應(yīng)物的水浴溫度可以調(diào)整。

1.6 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.6.1 常規(guī)不用微波輻射試驗(yàn)的最佳工藝

根據(jù)以前的研究成果[11]最佳反應(yīng)條件是：大豆蛋白與去離子水比例1︰8，蛋白酶與大豆蛋白比為5%，蛋白酶最佳反應(yīng)溫度為50 ℃，蛋白酶水解時(shí)間為300 min。

1.6.2 微波輻射最佳工藝條件分析

首先對(duì)微波輻射的功率、離子水與固態(tài)蛋白混合物比例、蛋白酶最佳反應(yīng)溫度、蛋白酶與大豆蛋白比、蛋白酶水解時(shí)間做單因素分析，根據(jù)以前研究文獻(xiàn)找出最佳的3個(gè)水平進(jìn)行分析[12-13]；并對(duì)4個(gè)因素做正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，找出最佳工藝條件。

1.6.3 高效液相色譜法分析工藝

用高效液相色譜法對(duì)常規(guī)酶解和微波酶解進(jìn)行比較分析，微波酶解能否縮短酶解時(shí)間和提高蛋白質(zhì)的水解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)準(zhǔn)備

分析根據(jù)以前研究成果，大豆蛋白與去離子水比例1︰8氨基氮的總量最大，其他因素根據(jù)前期成果采取3水平分析如下：微波輻射功率選擇320，480和640 W；微波輻射時(shí)間選擇40，60和80 min；蛋白酶與大豆蛋白比選擇4%，5%和6%；酶解溫度選擇45，50和55 ℃。根據(jù)上面的四因素三水平設(shè)計(jì)做正交試驗(yàn)（表1為試驗(yàn)因素與水平）

2.2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)分析

根據(jù)上述設(shè)計(jì)因素經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證（表2正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)）。根據(jù)表2試驗(yàn)結(jié)果對(duì)數(shù)據(jù)做極差分析（表3結(jié)果的各項(xiàng)指標(biāo)分析），由結(jié)果分析可知，所有反應(yīng)物中氨基態(tài)氮的含量在0.523 0～0.721 0 g/L之間。根據(jù)極差值（R）可知各因素的主次關(guān)系是A＞D＞B＞C。即影響的主要因素為蛋白酶用量和微波輻射功率。根據(jù)極差R值分析最優(yōu)的水平組合A3B2C1D3反應(yīng)物中氨基態(tài)氮的含量為0.721 0 g/L，微波輔助蛋白酶水解最佳工藝條件為：大豆蛋白與去離子水比例1︰8，蛋白酶與大豆蛋白比為5%，蛋白酶最佳反應(yīng)溫度為55 ℃，蛋白酶水解時(shí)間為60 min。

表1 試驗(yàn)因素與水平

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 結(jié)果的各項(xiàng)指標(biāo)分析

2.3 高效液相色譜法分析

高效液相色譜是20世紀(jì)70年代興起的新技術(shù)，現(xiàn)在在化工方面越來(lái)越多運(yùn)用于分析氨基酸，這種分析高效液相色譜對(duì)氨基酸含量分析速度和準(zhǔn)確性很好。主要用AQC柱前衍生技術(shù)測(cè)定常規(guī)不加微波條件下和加微波條件下氨基酸的組成及游離氨基酸的含量作對(duì)比分析。

2.3.1 試驗(yàn)材料

常規(guī)不加微波條件下：大豆蛋白與去離子水比例1︰8，木瓜蛋白酶與大豆蛋白比為5%，反應(yīng)物放置在自制的反應(yīng)器內(nèi)，把反應(yīng)器溫調(diào)到55 ℃，關(guān)閉微波輻射水解時(shí)間為300 min。

用480 W微波輔助反應(yīng)：大豆蛋白與去離子水比例1︰8，木瓜蛋白酶與大豆蛋白比為5%，反應(yīng)物放置在自制的反應(yīng)器內(nèi)，把反應(yīng)器溫調(diào)到55 ℃，打開(kāi)微波輻射水解時(shí)間為60 min。

把上述反應(yīng)物放在用電磁爐內(nèi)加熱煮10 min，使酶失活，然后用濾紙過(guò)濾，過(guò)濾后用冰箱封存。

2.3.2 分析方法

AQC柱前衍生技術(shù)。

2.3.3 試驗(yàn)方法

2.3.3.1 柱前衍生化操作步驟（參見(jiàn)表4）

2.3.3.2 游離氨基酸的提取

取常規(guī)不加微波條件下和加480 W微波條件下分別取5 mL反應(yīng)物和5 mL的三氯乙酸的溶液混合，靜置1 h后用雙層濾紙過(guò)濾后，用離心機(jī)在14 000 r/min，離心5 min，分別取上清液1.5 mL，上機(jī)測(cè)定。

2.3.4 結(jié)果與分析

2.3.4.1 氨基酸標(biāo)樣與酶解液色譜圖

分析如下：氨基酸標(biāo)樣色譜圖（圖6）、480 W微波輻射60 min氨基酸色譜圖（圖7）、常規(guī)不加微波反應(yīng)300 min氨基酸色譜圖（圖8）。

氨基酸標(biāo)樣、480 W微波輻射60 min氨基酸、常規(guī)不加微波反應(yīng)300 min氨基酸對(duì)比如表5，從表可以看出氨基酸標(biāo)樣保留時(shí)間重現(xiàn)度高，方法可以應(yīng)用。

表4 柱前衍生化操作步驟

圖6 氨基酸標(biāo)樣色譜圖

圖7 480 W微波輻射60 min氨基酸色譜圖

圖8 常規(guī)不加微波反應(yīng)300 min氨基酸色譜圖

表5 氨基酸標(biāo)樣、480 W微波輻射氨基酸和常規(guī)酶解反應(yīng)氨基酸保留時(shí)間對(duì)比

2.3.4.2 游離氨基酸的含量對(duì)比

由表6看出，常規(guī)酶解反應(yīng)300 min和480 W微波循環(huán)酶解60 min相比可以看出，經(jīng)微波輻射后人體代謝必要的蛋氨酸和精氨酸的含量比常規(guī)酶解明顯高。從氨基酸總量可以看出：常規(guī)酶解300 min氨基酸總量0.519 101 6 mg/mL，而480 W微波循環(huán)酶解60 min氨基酸總量就達(dá)到了0.616 339 3 mg/mL，說(shuō)明480 W微波循環(huán)酶解比常規(guī)不用酶解反應(yīng)相比縮短酶解時(shí)間和提高蛋白質(zhì)水解率。

表6 常規(guī)酶解反應(yīng)300 min和480 W微波輻射60 min游離氨基酸的含量比較

3 結(jié)論

自制了一套微波輻射-蛋白酶耦合反應(yīng)器，經(jīng)正交設(shè)計(jì)分析了微波輻射的最佳工藝條件：大豆蛋白與去離子水比例1︰8，蛋白酶與大豆蛋白比為5%，蛋白酶最佳反應(yīng)溫度為55 ℃，微波輻射水解時(shí)間為60 min。經(jīng)過(guò)高效液相色譜法分析常規(guī)酶解300 min氨基酸總量0.519 101 6 mg/mL，而480 W微波循環(huán)酶解60 min氨基酸總量就達(dá)到了0.616 339 3 mg/mL，反應(yīng)速率提高5倍，水解率提高了20%以上。裝置可為以后酶解的工業(yè)化提供了技術(shù)和設(shè)備支持。