澤蘭脂肪酸及揮發(fā)油提取及氣相色譜-質(zhì)譜分析

劉暢，陳建波，華梅，李珊珊，張磊，孫印石*

中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所（長春 130112）

澤蘭（Eupatorirm odoratum）為唇形科地筍屬植物地瓜兒苗的干燥全草，是一種常用中草藥。主產(chǎn)于黑龍江、遼寧、浙江、湖北等地。味苦、辛、微溫，歸肝、脾，具有活血化瘀、行水消腫之功效，用于治療月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、經(jīng)痛、產(chǎn)后淤血腹痛、水腫[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學中常用于多種腸胃疾病、各種肝病及并發(fā)癥，肺心病、心腦血管疾病的治療[2]。澤蘭具有很強的保健功效[3]，而且越來越多的藥理研究證實了澤蘭在健康方面的的應(yīng)用價值[4-8]。目前，澤蘭被我國衛(wèi)計委列為可用于保健食品的中藥，隨著我國健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，對澤蘭的研究開發(fā)越來越有必要性。

目前對于澤蘭化學成分的研究主要集中于對其地上莖葉的研究。研究人員采用多種方式對澤蘭的化學成分進行提取分離和鑒定，主要有黃酮類[9]、酚酸類[9-10]、萜類和甾類[11]、多糖類[12]等。對于澤蘭中揮發(fā)油的提取和分析研究較多[13-14]，脂肪酸的提取和分析研究偶見報道[15]，而對于SFE-CO2萃取方式提取澤蘭的成分，并用于脂肪酸測定，國內(nèi)外文獻報道甚少。

試驗采用SFE-CO2萃取對澤蘭進行了提取，分析了影響提取效率的因素，經(jīng)過甲酯化處理后，采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析技術(shù)對其化學成分進行分離，確認各成分及含量，同時對澤蘭中揮發(fā)油的成分進行了GC-MS的分析。這些數(shù)據(jù)為澤蘭的品質(zhì)評價及進一步研究開發(fā)提供了科學依據(jù)。

1 儀器與方法

1.1 材料與儀器

澤蘭采集于左家試驗站；HCl、KOH、甲醇、無水硫酸鈉、正己烷，均為分析純；37種脂肪酸甲酯混標，Sigma-Aldrich。

超臨界CO2萃取儀，Spe-ed SPE-prime，美國Applied separations有限公司；GC-MS聯(lián)用儀，Angilent 5975-6890 N，美國Agilent公司；數(shù)顯鼓風干燥箱，GZX-9140 MBE，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理

澤蘭的SFE-CO2萃?。簼商m經(jīng)過自然晾干、粉碎后，過60目篩。取23 g放入SFE-CO2萃取釜中。以壓力（30，35，40，45和50 MPa）、溫度（25，35，45，55和65 ℃）、萃取時間（0.5，1，2，3和4 h）為變量進行SFE-CO2萃取，樣品接入樣品瓶中，N2吹干，稱質(zhì)量，計算得率，加入20 mL正己烷溶解，于4 ℃冷藏待用。

脂肪酸測定樣品制備：準確吸取5 mL正己烷溶解的澤蘭提取物上清液于具塞試管，加入5 mL氫氧化鉀-甲醇溶液混勻，置于50 ℃水浴加熱回流1 h，取出，冷卻后加入15 mL 5% HCl。取上清液，用正己烷定容至10 mL，為脂肪酸甲酯化的樣品。量取1 mL脂肪酸甲酯化的樣品通過0.45 μm的濾膜于過濾樣品瓶中，作為供試品溶液，取1 μL進行SFE-CO2萃取物中脂肪酸的GC-MS分析。

揮發(fā)油測定樣品制備：準確吸取0.1 mL正己烷溶解的澤蘭提取物上清液，加入9.9 mL正己烷，稀釋100倍，待做GC-MS分析。

量取1 mL揮發(fā)油待測樣品上清液，通過0.45 μm的濾膜于樣品瓶中，作為供試品溶液，取1 μL進行SFE-CO2萃取物中揮發(fā)性成分的GC-MS分析。

1.2.2 GC-MS條件

脂肪酸分析GC條件：HP-88彈性石英毛細管柱（100 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序，初始溫度140 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至200 ℃，以3 ℃/min升至220 ℃，保持26 min；進樣量1.0 μL；載氣（He）流量1.0 mL/min；分流比80︰1；溶劑延遲3 min。

揮發(fā)性成分分析GC-條件：HP-5MS彈性石英毛細管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；升溫程序，初始55 ℃，保持1 min，以10 ℃/min速率升至180 ℃，保持1 min，再以3 ℃/min速率升至270 ℃，保持18 min；進樣量1 μL；載氣（He）流量1.0 mL/min；分流比10︰1；溶劑延遲3 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子（EI）源；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；接口溫度250 ℃；溶劑延遲時間5 min；掃描質(zhì)量范圍m/z 50～500。

2 結(jié)果與分析

2.1 SFE-CO2萃取條件單因素試驗結(jié)果

試驗對SFE-CO2萃取的壓力、溫度和時間因素進行了系統(tǒng)考察，結(jié)果如圖1所示。

當萃取溫度和時間固定時，隨著壓力的增加，壓力使罐內(nèi)CO2流體密度增加，流體溶解度增大，極性物質(zhì)的溶解能力增強，萃取率也隨之增加，當壓力超過45 MPa后，提取率基本保持平穩(wěn)，因此選擇40 MPa為最佳提取壓力。

當萃取壓力和時間固定時，隨萃取溫度升高，物料分子熱運動加速，有利于增加油脂在流體中的溶解度，提高得率。溫度在35～55 ℃之間，提取率變化不大；當溫度超過55 ℃后，提取率有所下降，可能因溫度的升高，CO2密度下降，使流體的溶解能力下降所致。另外，溫度過高也會導致成分的變性、分解。綜合提取率、能耗、成分穩(wěn)定性因素，選擇35 ℃為最優(yōu)提取溫度。

當萃取壓力和溫度固定時，提取率隨著時間的延長而增加，但增加的速率逐漸減緩，存在一個經(jīng)濟時間的終點。1.5 h后提取物的得率增長明顯緩慢，因此提取時間選擇1.5 h。

確定SFE-CO2提取澤蘭的最優(yōu)條件為：在35 ℃條件下，提取壓力為40 MPa，提取時間為1.5 h。得到的深綠色油狀物的質(zhì)量為0.571 2 g，萃取率為2.016%。

圖1 SFE-CO2萃取壓力、溫度、時間對產(chǎn)品得率的影響

2.2 澤蘭脂肪酸成分GC-MS分析

按上述GC-MS條件對SFE-CO2提取澤蘭的脂肪酸成分進行分析，其總離子流圖如圖2所示。對照標準品計算其含量，鑒定結(jié)果如表1和表2。澤蘭的SFECO2提取物中共測出脂肪酸16種，其中飽和脂肪酸11種，含量較高的有棕櫚酸、硬脂酸和二十二酸，其含量分別為100.05，67.42和64.29 μg/g；不飽和脂肪酸5種，其總量占脂肪酸含量的86.3%，其中含量最高的為α-亞麻酸，這與劉娜[11]的研究一致，其次為亞油酸、油酸，其含量分別為1 082.90，824.72和306.70 μg/g。

脂肪酸是人體必要的營養(yǎng)成分，其中不飽和脂肪酸對人體健康意義重大。不飽和脂肪酸中的亞油酸和亞麻酸人體不能合成，必須從外界獲得。α-亞麻酸對人體健康極其重要，它是構(gòu)成和生物酶的基礎(chǔ)物質(zhì)，對人體健康起決定性作用。缺乏α-亞麻酸將導致兒童大腦及視網(wǎng)膜發(fā)育遲緩，注意力不能集中，不能有效吸收營養(yǎng)物質(zhì)導致營養(yǎng)不均衡，直接影響智力發(fā)育，還會影響視力，導致厭食、肥胖、免疫力底下等30多種癥狀和疾病。然而α-亞麻酸在人體中普遍缺乏，及時補充α-亞油酸及其重要。亞油酸因其具有降低血液膽固醇，預(yù)防動脈粥樣硬化而備受重視。研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇必須與亞油酸結(jié)合后，才能在體內(nèi)進行正常的運轉(zhuǎn)和代謝。亞油酸可促進膽固醇和膽汁的排出，降低血中膽固醇的含量。試驗對澤蘭的脂肪酸分析結(jié)果顯示，不飽和脂肪酸占總脂肪酸含量的86.3%，為極高的比例，特別是相同碳原子數(shù)的油酸、亞油酸和α-亞麻酸含量最高，可能此次試驗篩選的SFE-CO2萃取壓力和溫度等條件剛好對上述幾種不飽和脂肪酸具有較高的萃取效率。

圖2 SFE-CO2萃取澤蘭脂肪酸GC-MS的總離子流圖

表2 SFE-CO2萃取澤蘭脂肪酸成分的種類和相對含量

2.3 澤蘭揮發(fā)性成分GC-MS分析

按上述GC-MS條件對SPF-CO2提取澤蘭的揮發(fā)性成分進行分析，其總離子流圖見圖3。對圖3中各色譜峰進行譜庫檢索及人工解析質(zhì)譜圖定性，以面積歸一化法測定其相對含量，結(jié)果見表3和表4。共檢出10種揮發(fā)性化合物，其中揮發(fā)性成分的GC-MS中檢出大量的烴類化合物，相對含量占總質(zhì)量的58.79%，其中含量最高的為甲苯，相對含量為42.99%；萜類化合物4種，相對含量為36.49%，其中石竹素含量最高，相對含量為18.72%；醇類化合物1種，為植物醇，相對含量為4.71%。試驗檢測到的揮發(fā)性成分物質(zhì)種類比其他檢測結(jié)果要少[13-14]，此差異可能是由于揮發(fā)性物質(zhì)的提取與檢測方法不同造成的。

此次試驗澤蘭中烴類物質(zhì)的含量較高，這與其他研究者的結(jié)果不一致[13-14]。萜類是植物揮發(fā)油中的重要組分，澤蘭樣品中檢出7.54%的巴倫西亞橘烯，呈柑橘似香氣；β-石竹烯，具有淡的丁香似香味，有局部麻醉、治療結(jié)腸炎、鎮(zhèn)咳等作用；石竹素，其具有修復受損性細胞和促進細胞再生、抗炎的功效，是中藥中重要的有效成分之一。醇類化合物中的植物醇[14]，其有很弱的花香和香脂香氣，天然存在于茉莉精油和茶葉中，具有抗氧化作用。這些成分可能與澤蘭的“活血調(diào)經(jīng)，祛瘀消癰，利水消腫”功效有關(guān)。

圖3 SFE-CO2萃取澤蘭揮發(fā)性成分GC-MS的總離子流圖

表3 SFE-CO2萃取澤蘭揮發(fā)性成分的GC-MS分析

表4 SFE-CO2萃取澤蘭揮發(fā)性成分的種類和相對含量

3 結(jié)論

通過對澤蘭揮發(fā)性成分和脂肪酸的分析，分離和鑒定出16種脂肪酸成分和10種揮發(fā)性成分。此次試驗的SFE-CO2萃取條件可能導致了部分不飽和脂肪酸成分的富集，因此不飽和脂肪酸在總脂肪酸中占有較高的含量，為86.3%。檢測到10種揮發(fā)性成分，其中巴倫西亞橘烯、β-石竹烯、石竹素、植物醇幾種成分具有一定的藥理作用，這可能與澤蘭的藥理功效有關(guān)。澤蘭具有較高的營養(yǎng)價值和醫(yī)療保健功效，研究結(jié)果將為進一步研究探討澤蘭的功效成分、防病致病機理等提供參考依據(jù)，同時為生產(chǎn)出療效確切、有效成分清楚、作用明確、毒副作用小的高品質(zhì)藥品和保健品奠定理論基礎(chǔ)。