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    生物素及膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵對黃色短桿菌生產(chǎn)L-亮氨酸的影響

    2019-05-23 05:17:26張玉富熊海波徐慶陽1陳寧1
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2019年9期
    關(guān)鍵詞:生物素糖酸發(fā)酵罐

    張玉富,熊海波,徐慶陽1,2,*,陳寧1,2,

    1(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室(天津科技大學),天津,300457) 2(天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室(天津科技大學),天津,300457) 3(天津科技大學 生物工程學院,天津,300457)

    常見的20種氨基酸中,L-亮氨酸(L-Leu)與L-異亮氨酸、L-纈氨酸稱為分支鏈氨基酸[1]。3種分支鏈氨基酸的生物合成途徑,部分共享相同的前體物質(zhì)和酶[2]。L-Leu在醫(yī)藥、動物飼料、食品、化妝品等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[3]。有文獻報道L-Leu在刺激肌肉蛋白合成和維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)中具有重要作用[4]。L-Leu也被用作一種調(diào)味劑和片劑生產(chǎn)的潤滑劑[5]。與其他大部分L-氨基酸的生產(chǎn)相似,微生物發(fā)酵法是當前工業(yè)生產(chǎn)L-Leu的主要方法[6],發(fā)酵生產(chǎn)L-Leu的菌種主要是谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌[7]。

    生物素是所有生物體都需要的水溶性維生素,因為它在糖異生、脂肪酸合成、氨基酸分解等代謝途徑中的羧化反應(yīng)中扮演著不可或缺的角色[8]。LI等[9]在初始培養(yǎng)基添加適量生物素,發(fā)酵中期補充一定量生物素,顯著提高了α-酮戊二酸的產(chǎn)量。由于生物精煉過程中生物素保持穩(wěn)定,玉米秸稈水解液中生物素含量高,Corynebacteriumglutamicum產(chǎn)谷氨酸量極少[10]。生物素不足,抑制谷氨酸棒桿菌的生長,而生物素過量影響谷氨酸的分泌[10-12],生產(chǎn)過程通過添加Tween[13]、青霉素[14]、乙胺丁醇[15]或者控制溫度[16]提高谷氨酸的產(chǎn)量。生物素對Corynebacteriumglutamicum生長狀態(tài)及產(chǎn)谷氨酸影響機制已被報道[17-18]。生物素對黃色短桿菌產(chǎn)L-Leu的影響未見報道,本文考察了不同濃度生物素對L-Leu發(fā)酵的影響,并運用膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵技術(shù),使L-Leu產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率顯著提高,副產(chǎn)物L-丙氨酸(L-Ala)含量減少。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 供試菌株

    黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)TK0303(Met-+IleL+2-TAr+α-ABr+β-HLr+Rifr+SGr),天津科技大學代謝工程研究室保藏。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    見參考文獻[19]。

    1.1.3 主要儀器

    發(fā)酵罐(5、30 L全自動發(fā)酵罐),上海保興生物設(shè)備工程公司;SBA-40C生物傳感儀,山東科學院生物研究所;pH電極、溶氧電極,METTLER TOLEDO;LC20AT高效液相色譜儀,日本Shimadzu公司;TU 1810紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器;FA2204B電子天平,上海精密科學儀器有限公司。

    1.2 培養(yǎng)方法

    1.2.1 接種量對搖瓶分批發(fā)酵黃色短桿菌產(chǎn)L-Leu的影響

    用接種環(huán)取1環(huán)斜面活化菌種,接種于錐形瓶,31 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h,作為種子液。按照2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%接種量分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,31 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng),氨水調(diào)節(jié)pH值至7.0,每個處理進行3個平行實驗。檢測培養(yǎng)44 h后不同接種量下L-Leu的濃度。

    1.2.2 種子培養(yǎng)

    吸取適量無菌生理鹽水于5支活化斜面中,將菌懸液接入5 L種子罐中,初始通氣量1 L/min;攪拌轉(zhuǎn)速300~700 r/min;通過自動流加氨水控制pH在7.0;培養(yǎng)溫度31 ℃;以泡敵消泡;培養(yǎng)16 h后,按一定接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。

    1.2.3 30 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵

    按搖瓶分批發(fā)酵最適接種量將種子液接入30 L發(fā)酵罐中;初始通氣量2 L/min;攪拌轉(zhuǎn)速500~800 r/min;通過自動流加氨水控制pH值在7.0;培養(yǎng)溫度31 ℃;以泡敵消泡;發(fā)酵過程中,葡萄糖按一定的流加方式補入;發(fā)酵周期44 h[20]。發(fā)酵培養(yǎng)基中,添加20、50、80、120 μg/L生物素,通過四聯(lián)發(fā)酵罐同時進行分批補料發(fā)酵,重復(fù)3個批次。

    1.2.4 膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵

    見參考文獻[21]。

    1.3 分析方法

    1.3.1 菌體濃度測定

    每隔4 h取適量發(fā)酵液,滅菌生理鹽水適當倍數(shù)稀釋,通過分光光度計測定600 nm波長下吸光度。

    1.3.2 溶氧及pH值測定

    在線測定。

    1.3.3 葡萄糖濃度

    取適量發(fā)酵液12 000 r/min離心5 min,取上清液稀釋適當倍數(shù),用生物傳感儀測定。

    1.3.4L-Leu及L-Ala濃度

    發(fā)酵液中L-Leu/L-Ala濃度用高效液相色譜法分析測定[19]。采用Agilent C18(15 mm×4.6 mm,3.5 μm)色譜柱,衍生劑為2,4-二硝基氟苯,柱前衍生,流動相為50%的乙腈、4.1 g/L的醋酸鈉溶液,柱溫33 ℃,流速1 mL/min,檢測波長360 nm。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 接種量對搖瓶分批發(fā)酵黃色短桿菌產(chǎn)L-Leu的影響

    通過搖瓶分批發(fā)酵實驗,考察了不同接種量對L-Leu產(chǎn)量的影響,結(jié)果如圖1所示。接種量為2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%時,發(fā)酵終點L-Leu的產(chǎn)量分別為13.3、15.0、15.8、18.2、22.5、21.0、20.5 g/L。其中接種量為10%時,L-Leu的產(chǎn)量最高,而接種量過高或者過低均不利于黃色短桿菌生產(chǎn)L-Leu。

    圖1 接種量對L-Leu發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of different inoculum size on L-Leu fermentation

    2.2 生物素濃度對L-Leu生產(chǎn)菌的菌體生長、耗糖及產(chǎn)量的影響

    生物素作為酶的組成成分,參與機體的三大營養(yǎng)物質(zhì)——糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝,是生物體不可缺乏的重要營養(yǎng)物質(zhì)之一。在白色鏈球菌發(fā)酵中期加入適量生物素,能顯著提高ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量[22]。微生物發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸,生物素初始濃度對異檸檬酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶的轉(zhuǎn)錄水平及谷氨酸分泌影響很大[23]。限制培養(yǎng)基生物素濃度,?;鵆oA羧化酶活性降低,影響脂肪酸和分枝酸合成,細胞膜通透性增加,促進C.glutamicum分泌L-谷氨酸[24]。在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加20、50、80、120 μg/L生物素,每隔4 h測定菌體濃度、糖濃度、L-Leu濃度,結(jié)果如圖2。

    A-菌體濃度;B-殘?zhí)呛?;C-L-Leu產(chǎn)量圖2 不同濃度生物素對L-Leu發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of different concentrations of biotin on L-Leu fermentation

    當生物素濃度提高,L-Leu生產(chǎn)菌能快速繁殖,較快進入生長穩(wěn)定期。隨著生物素濃度升高,菌體濃度也高。添加20、50、80、120 μg/L生物素,發(fā)酵液稀釋20倍,菌體濃度OD600分別能達到1.59、1.67、1.71、1.74。高濃度生物素使得糖代謝速率加快,加入120 μg/L生物素,16 h后發(fā)酵液殘?zhí)菨舛燃吹陀?0 g/L,加入20、50、80 μg/L生物素,發(fā)酵液殘?zhí)堑陀?0 g/L的時間相對滯后。生物素質(zhì)量濃度為20、50、80、120 μg/L,發(fā)酵終點L-Leu的質(zhì)量濃度分別為36、60、51、45 g/L。生物素濃度對菌體生長和L-Leu的積累都有影響。生物素濃度過高或者過低,L-Leu的產(chǎn)量均低,這與谷氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)規(guī)律一致[11, 25]。

    2.3 不同生物素濃度對L-Leu生產(chǎn)菌轉(zhuǎn)化率、副產(chǎn)物L-Ala的影響

    通過高效液相色譜測定了不同生物素濃度下,不同時間點的L-Leu及副產(chǎn)物L-Ala的濃度,計算L-Leu的糖酸轉(zhuǎn)化率,結(jié)果如圖3所示。發(fā)酵液中生物素質(zhì)量濃度為20、50、80、120 μg/L,轉(zhuǎn)化率分別為19%、22%、18%、15%,副產(chǎn)物L-Ala的質(zhì)量濃度分別為7、8、11、15 g/L。添加高濃度的生物素,副產(chǎn)物L-Ala隨之增加。當生物素質(zhì)量濃度為50 μg/L時,糖酸轉(zhuǎn)化率最高,謝希賢等[26]通過定向選育得到L-Leu高產(chǎn)菌,糖酸轉(zhuǎn)化率相近。丙酮酸是分支鏈氨基酸的共同前體物,α-酮基異戊酸是L-纈氨酸的直接前體物,也是L-亮氨酸的間接前體物。此外,丙酮酸也可以與谷氨酸在谷-丙轉(zhuǎn)氨酶的作用下形成丙氨酸,此反應(yīng)過程是可逆的,且無反饋抑制效應(yīng)。添加較低濃度的生物素,副產(chǎn)物L-Ala濃度也低,可能是低濃度的生物素使得丙酮酸生成丙氨酸的反應(yīng)減弱。

    A-糖酸轉(zhuǎn)化率;B-L-Ala的生成量圖3 添加不同濃度生物素,對糖酸轉(zhuǎn)化率、副產(chǎn)物L-Ala生成的影響Fig.3 Effect of adding different concentrations of biotin on the glucose conversion rate and the formation of by-product L-Ala, the glucose conversion rate and the yield of L-Ala

    2.4 膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵研究

    膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵工藝,即在普通發(fā)酵的基礎(chǔ)上,將發(fā)酵罐與陶瓷膜相偶聯(lián),發(fā)酵一定時間后,將發(fā)酵罐中的發(fā)酵液經(jīng)由陶瓷膜分離,將透析濾液排出,把濃縮菌體打回發(fā)酵罐,同時向發(fā)酵罐中補加透析培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵[27]。此工藝能有效解除胞內(nèi)產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)作用及有毒害副產(chǎn)物的抑制作用,促使產(chǎn)酸增加,產(chǎn)酸速率提高。戶紅通等[21]采用膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵工藝,谷氨酸產(chǎn)量提高了94.6%,糖酸轉(zhuǎn)化率提高了3.5%。當生物素添加量為50 μg/L時,L-Leu的產(chǎn)量最高,而副產(chǎn)物L-Ala相對較高。為降低L-Leu后續(xù)處理難度,提高產(chǎn)品純度,采用膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵工藝在不同時間點測定L-Leu與L-Ala產(chǎn)量及對比結(jié)果,如圖4所示。

    A-普通發(fā)酵工藝; B-膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵工藝圖4 普通發(fā)酵工藝與膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵工藝L-Leu與L-Ala的產(chǎn)量Fig.4 Production of L-Leu and L-Ala by common fermen-tation process and membrane coupled intermittent dialysis fermentation process

    普通發(fā)酵工藝,發(fā)酵終點L-Leu的產(chǎn)量為60 g/L,副產(chǎn)物L-Ala的質(zhì)量濃度為8 g/L,且發(fā)酵36 h后L-Ala的生成速率增大。采用膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵工藝,發(fā)酵36 h,L-Leu的產(chǎn)量為54 g/L,L-Ala的產(chǎn)量為1.8 g/L,膜過濾透析,補加透析培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵20 h,發(fā)酵終點L-Leu的產(chǎn)量為36 g/L,L-Ala的產(chǎn)量為2.3 g/L。此外,對2種發(fā)酵工藝的總產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)率進行比較,結(jié)果如圖5。

    A-糖酸轉(zhuǎn)化率、副產(chǎn)物、總產(chǎn)量;B-產(chǎn)率圖5 糖酸轉(zhuǎn)化率、副產(chǎn)物、總產(chǎn)量(A)及產(chǎn)率(B)的比較Fig.5 Comparison of glucose conversion rate, by-products, total production (A) and production rate (B)

    普通發(fā)酵工藝,30 L發(fā)酵罐L-Leu的總產(chǎn)量約為1 200 g,糖酸轉(zhuǎn)化率為22%,而膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵工藝L-Leu的總產(chǎn)量約為1 400 g,糖酸轉(zhuǎn)化率為25%,分別提升16.7%、13.6%。采用膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵工藝,發(fā)酵36 h之前(透析前),與普通發(fā)酵工藝的產(chǎn)率相近,其中26 h的產(chǎn)率最高,接近3 g/(L·h),而36 h后,可以快速達到較高的產(chǎn)率。采用膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵工藝,能降低發(fā)酵液L-Leu濃度,減輕其對L-Leu合成途徑關(guān)鍵酶的反饋抑制和反饋阻遏,去除了有害代謝產(chǎn)物,提高了糖利用率,而且透析后進一步提升了L-Leu的生產(chǎn)效率。通過透析處理降低了副產(chǎn)物L-Ala的濃度,降低后續(xù)分離提純L-Leu的難度。

    3 結(jié)論

    本文以黃色短桿菌為研究對象,分析了培養(yǎng)基不同生物素的濃度對L-Leu發(fā)酵生產(chǎn)的影響。結(jié)果表明,生物素濃度高,菌體生長快、菌體量大,生物素濃度過低,菌體生長慢、菌體量少,不利于L-Leu的生成。通過控制生物素濃度,調(diào)節(jié)細胞膜通透性[28],使L-Leu非積累型細胞向L-Leu積累型細胞轉(zhuǎn)變。當生物素濃度升高,副產(chǎn)物L-Ala的濃度隨之升高,生物素濃度為120 μg/L,L-Ala濃度比生物素質(zhì)量濃度為50 μg/L時高87.5%。生物素添加量為50 μg/L時,L-Leu的產(chǎn)量為60 g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率為22%。在最適生物素濃度下,采用膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵,L-Leu的總產(chǎn)量較普通發(fā)酵工藝提高了16.7%,糖酸轉(zhuǎn)化率為25%,提高約13.6%。透析后可以使得產(chǎn)酸速率提高,有效降低了副產(chǎn)物L-Ala濃度。本研究為工業(yè)化高產(chǎn)L-Leu發(fā)酵提供理論依據(jù)。

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